1、免疫组化基本技术（四）,(二)内源性碱性磷酸酶的消除方法 1. 10醋酸 10min 2. 0.5mol/L碳酸氢钠（pH9.0） 20min 3. 1mol/L左旋咪唑 20min,(三)内源性生物素的消除方法 1.用2-甲基-D苷露糖饱和生物素 2.先用25g/ml卵白素孵育15min，PBS洗10min，移至生物素饱和液中处理15min，PBS洗15min。,四、IHC的非特异性染色 1.特异性抗体不纯 2.抗体免疫球蛋白所带电荷与检测组织所带电荷差异很大，可引起非特异染色。 3.IgG的交叉反应,4.共同抗原决定簇 5.单一决定簇抗体的异质性 6.特异性抗原弥散 7.IgG受体干扰 8
2、.鼠源性抗体检测鼠源性组织,9.内源性抗生物素蛋白结合物内源性抗生物素蛋白指的是体内能够与生物素蛋白结合的分子或基团，在体内含有这种分子或基团的物质主要是内源性生物素。可以用20%蛋清封闭，或用2%卵蛋白进行封闭，或不采用亲和细胞化学方法。,解决方法： 1.用正常二抗血清吸附 2.将组织用酶消化或抗原修复 3.二抗用木瓜酶将抗体结合部Fab切除 4.高度稀释特异性一抗,五、酶消化和抗原修复 1.为什么要进行酶消化和抗原修复？ (1)固定液的影响 自1893年Ferdinand Blum创立组织固定以来，为了避免组织固定液对抗原决定簇的影响，已经寻找到几十种固定液，目的就是为了对一定抗原起到保护
3、作用，同时还能获得良好的组织形态结构。,目前无一种固定液适用于所有的抗原，从组织细微结构的保存，稳定、简便和廉价综合评估上，甲醛最优。,甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之间会发生交联，交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变，而影响检测。 (2)抗体制备的影响,2.酶消化 (1)原理： 1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白 2)断交联,(2)蛋白酶的种类 胰蛋白酶0.05%0.1胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用0.1N NaoH调pH至7.8。消化时间37 30min。,胃蛋白酶 0.4%胃蛋白酶，用0.01N HCI稀释，消化时间37 30180mi
4、n。 蛋白酶K 20g/ml，用pH8.0 0.5M Tris-HCI配制，消化时间37 2040min。,链酶蛋白酶 0.1%，用pH 7.4,0.5M Tris-Hcl稀释，消化时间37 14h。 无花果蛋白酶 0.1%浓度，用0.2M pH7.4 PBS稀释，消化时间37 3060min。,菠萝蛋白酶 其浓度为0.4%1，溶在0.01M，pH7.4 PBS中，37消化30120min。 尿素 浓度3M 37 530min,(3)原则及注意事项 胃蛋白酶和菠萝蛋白酶主要用于细胞间质抗原的检测前消化，其余蛋白酶均为细胞内抗原的显示消化。 在配制和使用时应考虑到酶激活的最佳pH值，消化温度、浓
5、度和孵育时间。,3.热诱导的抗原修复：抗原修复(Antigen Retrieval;AR)是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。,(1)依据：40年代美国学者Fraenkel-conrat等实验证实，甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团(抗原决定簇)如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过120高温或强碱处理后，可使交联打开。,(2)修复方式：微波9610min2；直接加温100，15min；水浴锅100，15min；高压锅/消毒锅120，5min；真空加热10min；直接烤片法。,(3)修复介质：0.05MEDTA
6、;0.05MEGTA; 0.01M pH6.0柠檬酸缓冲液(CB)；0.05MTris-HCL(pH1-12系列);0.01M pH7.0 PBS;2%硫酸铝；2硝酸铝；生理盐水；蒸馏水; 认为修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而pH值则影响较大。缓冲液以CB和Tris-HCL较常见。,(4)温度与修复时间的关系：许多的实验结果表明，温度高修复时间短，呈正相关。例如，Ki-67、P-gp的检测，利用同一切片，达到相同的染色结果如下步骤：100 20min；90 40min；80 60min；70 20h。 (5)选择最佳的修复方法,根据下表选择最佳的修复方法,柠檬酸Buffer
7、pH1-2 PH6 pH10-11 Tris-HCL Buffer pH1-2 pH8 pH10-11 微波100 10min2 切片1 切片2 切片3 压力锅120 10min 切片4 切片5 切片6 微波或水浴锅90 30min 切片7 切片8 切片9切片10作阳性对照，不作任何处理,(6)AR应注意的问题：高温AR因其机理尚不清楚，对某些存在的问题或现象不可能用设计对照的方法加以解决或解释清楚，例如，有些抗体在冰冻切片上不表达，或表达率很低，但石蜡切片用AR后，却能很好地表达；,某些应表达在胞浆或膜上的抗原，经过量修复后，绝大部分表达在核内；某些应表达在核内的抗原，经过量修复后出现在细胞浆内。因此对结果的判断要作出客观的分析。在操作过程中还应注意如下问题：,热处理后应注意自然冷却； 热处理液不要让其煮干； 不要任何抗原的检测都使用该方法； 一批抗原的检测其温度和时间一定保 持一致；,形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核内影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。 如果在常用的修复液无法得到阳性结果，或经修复后抗原定位发生改变，可改用某些不常用的修复液，或加一些螯合剂，如EDTA和EGTA等可改善某些抗原的修复。,
