1、实验三 细胞培养用液的配制,动物细胞在体内靠组织液维持生存，在体外培养就需要培养基，以供给细胞所需营养、调控细胞生长增殖、保证细胞能够正常代谢。,天然培养基,早期细胞培养以血浆、血清、胎汁、淋巴液等组织液为培养基。 费用高、效果不稳定。,人工培养基,根据已知细胞所需物质的种类、数量配制的培养液。缺乏细胞的分裂激素、生长因子，需添加一定量的血清。 M199 DMEM MEM RPMI1640,由于不同来源血清存在不同的生物学效应及细胞生长的不稳定性，目前仍期待无血清培养基。,培养用液,1. 平衡盐溶液（BSS),无机盐组成，维持细胞渗透压、调控培养液的酸碱平衡。Hanks D-Hanks PBS
2、 Tyrode Earle,2. 细胞消化液,胰蛋白酶溶液，原代培养时解离组织块儿、传代培养时使贴壁细胞脱离培养器皿表面。,3. 抗生素溶液（SP）,青霉素加链霉素溶液，防止微生物污染。,Hanks： a. 将CaCl2 加入约100ml水中溶解；b. 其它成分依次加入约200ml 水中溶解；c. 将a缓慢加入b并不时搅动；d.加入少许酚红呈桃红色。定容至500ml。过滤除菌分装于两个大储液瓶，封口，4冰箱保存。 -（1、3、5 组配制）,D-Hanks： 各成分依次加入约200ml 水中溶解；加入少许酚红呈桃红色；定容至500ml待用。 （2、4、6 组配制）,一. BSS 配方（g/500
3、ml）及配制方法,二. 消化液的配制方法,三. SP的配制方法,四. M199配制方法,取胰蛋白酶0.125g溶解于约40mlD-Hanks,定容至50ml。过滤分装于8个青瓶，封、存。,取16ml超纯水溶入160万单位青霉素，留10ml稀释到50ml，再溶入100万单位链霉素，混匀备用。,在约150ml水中加入 M199 1.96g；NaHCO3 0.44g；hepes 0.24g；S.P.2ml，定容至200ml，过滤分装于2个小储液瓶，封、存。,注意. 每组上交8个青瓶及8个胶盖，集中分装血清待用。,实验四 消毒灭菌及无菌操作,细胞培养的每个环节都应该严格进行无菌操作，防止细菌、真菌和病
4、毒污染。,一. 灭菌方法,1.物理灭菌,紫外线消毒,高压湿热消毒,过滤除菌,2.化学消毒,75%乙醇,火焰杀菌,0.2%的新吉尔灭,3.抗生素消毒,青霉素 链霉素,二. 无菌操作,1. 无菌室消毒,新吉尔灭擦拭，紫外线照射（20-30分钟）。,2. 洗手、着装,新吉尔灭洗手、擦洗用具外部； 穿戴无菌服、 帽 、口罩。,4. 超净工作台,3. 火焰烧灼,剪、镊、瓶口、瓶盖、吸管口 适度 过火烧,无菌区,单向过滤风,注意事项,1. 不同药品用不同的药匙取，少量多取，出瓶药不放回； 2. 操作要准确、敏捷，但不能太快； 3. 笔记等用具不能带入无菌室 4. 出进无菌室严防空气对流； 5. 工作台上的
5、用品布局要合理； 6. 不能触及器皿的无菌部位；一旦触及要更换或用火焰烧灼； 7. 烧过的用具待冷却再用； 8. 培养用液不要过早开盖儿，不要长时间直立暴露瓶口； 9. 不同用液不要用一支吸管吸取； 10. 用过的用具清洗后放回储存柜，不准丢失。,Hanks： a. 将CaCl2 加入约100ml水中溶解；b. 其它成分依次加入约200ml 水中溶解；c. 将a缓慢加入b并不时搅动；d.加入少许酚红呈桃红色。定容至500ml。过滤除菌分装于两个大储液瓶，封口，4冰箱保存。,D-Hanks： 分依次加入200ml 水中溶解；加入少许酚红呈桃红色；定容至500ml待用。,一. BSS 配方（g/500ml）及配制方法,二. 消化液的配制方法,三. SP的配制方法,四. M199配制方法,取胰蛋白酶0.125g溶解于约40mlD-Hanks,定容至50ml。过滤分装于8个青瓶，封、存。,取16ml超纯水溶入160万单位青霉素，留10ml稀释到50ml，再溶入100万单位链霉素，混匀备用。,在约150ml水中加入 M199 1.96g；NaHCO3 0.44g；hepes 0.24g；S.P.2ml，定容至200ml，过滤分装于2个小储液瓶，封、存。,
