1、仿生肝病治疗仪对慢性乙型肝炎免疫调节作用的研究作者：熊一力 1，熊伟宏 2，王增松 2 作者单位：1 510620 广东广州，广州仁爱天河医院肝病科 2 广东广州，广州市恺泰生物科技有限公司 【摘要】 目的 观察仿生肝病治疗仪对慢性乙型肝炎（CHB）患者细胞免疫和乙型肝炎病毒（HBV）复制的影响，旨在探讨该治疗仪治疗 CHB 的作用和作用机制。方法 仿生肝病治疗仪联合拉米夫定治疗免疫耐受期的 CHB 患者，并设单用拉米夫定对照组。用ELISA 法和实时荧光定量 PCR 法分别检测治疗前和治疗 12 周及 24 周时两组患者 PBMCs上清液 INF- 和血清 HBV-DNA 含量。结果 仿生肝
2、病治疗仪联合拉米夫定治疗后，诱生PBMCs 产生 IFN- 显著增强（P0.050.01） ，HBV-DNA 有效下降率也显著高于对照组（P0.05 ） 。结论 仿生肝病治疗仪联合拉米夫定治疗 CHB 可上调 CHB 患者细胞免疫应答，诱生细胞因子 IFN-，抑制 HBV 复制，优于单用拉米夫定治疗。【关键词】 仿生肝病治疗仪； 慢性乙型肝炎； IFN- ； HBV【中图分类号】 R-33 【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2010)01-0013-03Modulatory function of HDBMI to immune responses in CHB patie
3、ntsXIONG Yi-li，XIONG Wei-hong,WANG Zeng-song.Department of Liver Disease,Renai Tianhe Hospital,Guangzhou 510620,China【Abstract】 Objective To observe the clinical effects of the bionic medical-instrument with microcomputer on hepatic diseases of type WF(HDBMI) on cellular immune response and reproduc
4、e of HBV in chronic hepatitis B(CHB) patients. Methods The CHB patients in stage of immune tolerance were treated separately with HDBMI plus Lamivudine in the therapeutic group and only with Lamivudine in control group. Before treatment and at treatment point of 12 week and 24 week ,IFN- levels in t
5、he culture supernatant of PBMCs were determined by ELASA and the contents of serum HBV DNA were detected by the PCR method in all patients of two groups.Results The levels of IFN- were obviously enhanced(P0.050.01) and percentage to inhibited serum HBV DNA was significantly inceased (P0.05) in the t
6、herapeutic group than that in the control group. Conclusion HDBMI plus Lamivudine can upregulate cellular immune responses, induce IFN-, inhibit the reproduce of HBV DNA and is quite effective than Lamivudine alone.【Key words】 HDBMI; chronic hepatitis B; IFN-; HBV慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B, CHB）迁延难愈
7、和乙型肝炎病毒（hepatitis B virus ，HBV ）持续感染的主要原因是机体对 HBV 产生了免疫耐受。通过免疫调节，打破免疫耐受，增强细胞免疫应答，使机体主动清除 HBV，已成为 CHB 治疗的研究热点1 。近年发现多种肝病治疗仪在辅助治疗 CHB 时取得较好疗效，但其作用是否与纠正 CHB 免疫耐受有关，还有待证实24 。本研究用 WF 微电脑仿生肝病治疗仪（以下简称“ 仿生肝病治疗仪“ ）联合抗病毒药拉米夫定治疗免疫耐受期的 CHB 患者后，检测患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）培养上清液中 干扰素（IFN
8、-）和血清 HBV-DNA 含量。观察仿生肝病治疗仪对细胞免疫和 HBV 复制的影响，以探讨其治疗 CHB 的作用和作用机制。1 材料与方法1.1 材料 据中华医学会 慢性乙型肝炎防治指南诊断标准，选择 2009 年来本院就诊的慢性乙肝患者 40 例，男 27 例，女 13 例；年龄 2140 岁。均为 HBsAg 阳性、HBeAg 阳性、 HBV-DNA104、ALT 和 AST 正常（免疫耐受期） 、未接受过抗病毒治疗并排除 HAV、HCV、HDV、HEV 混合感染和药物、酒精、中毒等造成的肝损害。拉米夫定（葛兰素史克公司）,WF 微电脑仿生肝病治疗仪（江苏中普科技公司） ；重组 HBsA
9、g 疫苗（深圳康泰生物制品公司） ，RPMI-1640、Hanks（GIBCO, 美国） ，胎牛血清（GIBCO, 美国） ，Ficoll 淋巴细胞分离液（上海华精公司） ，Anti-human CD3（BioLegend，美国） ，人IFN- 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒和 TMB 底物显色剂（BD-Pharmingen ，美国） ，HBV-DNA 实时荧光定量 PCR 试剂盒（达安基因公司） ；Multiskan MK3 酶标仪（芬兰 Thermo 公司） 。1.2 方法 1.2.1 分组及治疗方法1.2.1.1 治疗组 选免疫耐受期的乙肝患者 20 例，口服拉米夫定 0.1g
10、/次，1 次/ 日24 周。用仿生肝病治疗仪，30min/次，1 次/周24 次。患者平卧位，仿生肝病治疗仪电极隔纱布垫置于肝区，电信号刺激强度据患者耐受程度调整，逐渐增强。1.2.1.2 对照组 选免疫耐受期的乙肝患者 20 例，口服拉米夫定 0.1g/次，1 次/日24 周,不用仿生肝病治疗仪治疗。两组均在治疗前、治疗第 12 周和第 24 周时抽血，分别检测患者外周血 PBMCs 上清液 INF- 和血清 HBV-DNA 含量。1.2.2 检测方法 取受检者新鲜外周静脉血 5ml/人，肝素 20U/ml 抗凝，经 RPMI-1640 1：1 稀释后，用 Ficoll 淋巴细胞分离液按常规
11、方法分离 PBMCs，RPMI-1640 洗涤 2次，最终用 RPMI-1640（1ml，含 10%胎牛血清）悬浮细胞，调整细胞浓度为 2106/ml。用台盼蓝检测细胞活力，细胞活力95%以上备用。将细胞悬液加入 96 孔培养板中（100l/孔） 。每孔加入 HBsAg（0.5g/ml）100l ，并设生理盐水空白对照和抗人 CD3阳性对照。置于 37、5%CO2 的培养箱中孵育 48h 后，无菌条件下每孔收集 50l 上清液，用 ELISA 法检测上清液中 INF- 含量。血清 HBV-DNA 含量检测用荧光定量 PCR 方法，参考检测试剂盒说明书。1.3 统计学处理 本文检测数据用 xs
12、表示 ,采用 SPSS13.0 软件处理进行 t 检验和2 检验。2 结果见表 1、表 2。表 1 仿生肝病治疗仪对慢性乙肝患者 PBMCs 诱生 IFN- 的影响 (xs)注：与对照组比，*P0.05，*P0.01 表 2 两组慢性乙肝患者治疗 24 周时 HBV-DNA 有效下降率（略）注：与对照组比，*P0.053 讨论 CHB 免疫耐受是指宿主细胞免疫功能缺陷，对 HBV 抗原不产生特异性免疫应答或低应答，导致免疫系统与 HBV“和平共处“，造成 HBV 持续复制5 。HBV 进入人体后，首先由树突状细胞（Dentritic cell, DC）在外周组织识别、摄取、处理 HBV 后，把
13、 HBV 抗原递呈给 T 细胞并激活之。活化 T 细胞分泌细胞因子 IFN- 、IL-2 等，来清除 HBV6 。HBV 慢性感染者，DC 递呈 HBV 能力低下，使 T 细胞活化受限，产生细胞因子 IFN- 等免疫活性物质减少，出现对 HBV 无应答或低应答。因而寻找免疫调节疗法，激活细胞免疫，诱生 IFN- 等细胞因子，清除 HBV 是治疗 CHB 的重要环节7 。近年国内外研制了多种肝病治疗仪来治疗 CHB,该类仪器根据中医经络学理论, 运用计算机精控技术,电子脉冲技术,通过电子波刺激人体穴位，产生电、热、磁、药作用而达到疏经通络，改善微循环，辅助清除病毒等24 。但治疗仪对 CHB 的
14、免疫调节作用尚未见报道。本研究发现：仿生肝病治疗仪联合拉米夫定治疗后，诱生患者 PBMCs 产生 IFN-显著高于单用拉米夫定组（P0.050.01） ，且随着治疗次数、时间的增加，这种增强特异性细胞免疫应答的作用也随之增强。与此同时治疗组 HBV-DNA 有效下降率也显著高于对照组（P0.05） 。说明治疗仪能上调特异性细胞免疫应答，诱生细胞因子 IFN-，从而打破免疫耐受，抑制 HBV 复制，达到主动清除 HBV 的作用。此结果为仿生肝病治疗仪治疗CHB 的作用和作用机制提供了重要的实验依据。CHB 的免疫治疗应以打破免疫耐受为始动，调节异常细胞免疫应答为中心，清除肝细胞内 HBV 为目的
15、来进行。单一的免疫疗法想彻底清除 HBV，治愈 CHB 很难，抗 HBV 治疗迄今仍是关键的治疗措施8 。抗 HBV 药拉米夫定等，可抑制 HBV 复制，但难以彻底清除 HBV，疗效远不令人满意。可见单一的抗 HBV 与单一的免疫疗法都有一定局限性，因而对 CHB 多需两者联合治疗才能奏效9 。但如何发挥各自的优点，并使两者相辅相成？如何使抗 HBV 有多位点，多途径，主动加被动？如何高效而无反跳的抑制和清除肝细胞内 HBV？这些要求使免疫疗法与抗 HBV 药物的联合应用成了当今亟待解决的问题之一10 。鉴于此，我们选用了仿生肝病治疗仪与拉米夫定联合治疗方案。研究结果表明：此联合治疗方案对 C
16、HB 的疗效优于单用抗 HBV 药。但本研究病例数尚有限，该治疗方案的有效性还有待进一步验证。【参考文献】1 Keeffe EB,Dieterich DT,Han SH,et al. A treatment algorithm for the management of chronic hepatitis B virus infection in the United States: an update. Clin Gastroenterol Hepatol,2006,4:936-962.2 黄建荣,施维群,朱菊珍,等. DSG-I 型电脑肝病治疗仪治疗慢性乙型肝炎和肝炎肝硬化. 药品评价,2
17、007,4(1):37-39.3 李野平,张均倡,徐志斌 ,等.慢性病毒性肝炎患者使用 YB-ZG 肝病治疗仪的临床疗效观察. 湖北中医学院学报,2003,5(2):1.4 欧阳伟,巨立中,聂庆平，等.肝病治疗仪治疗慢性病毒性乙型肝炎患者肝功能及免疫功能的临床研究.中华现代中西医杂志, 2005,3(15):1.5 Senturk H, Tabazk F, Akdogan M,et al. Therapeutic vaccination in chronic hepatitis B. J Gastroenterol Hepatol.2002，17（1）：72.6 Lok AS,McMahon
18、BJ. Chronic hepatitis B.Hepatology,2007,45:507-539.7 Akbar SM, Abe M, Masumoto T,et al. Mechanism of action of vaccine therapy in murine hepatitis B virus carriers: vaccine-induced activation of antigen presenting dendritic cells. J Hepatol, 1999,30(5):755.8 Xiong YL. Hepatitis B virus transgenic mi
19、ce for model of antihepatitis B virus drug study.Chemical Abstracts,2002,136 (6) : 83786.9 徐启恒 ,张晓红,谢冬英 ,等. 重组酵母乙型肝炎疫苗疫苗联合干扰素 -1b 治疗慢性乙型肝炎的疗效. 中华传染病杂志,2008,26(3):163-167.10 Pol S, Nalpas B, Driss F,et al. Multicenter study group. Efficacy and limitations of a specific immunotherapy in chronic hepatitis B. J Hepatol，2001，34(6):917-921.申明：本论文版权归原刊发杂志社所有，我们转载的目的是用于学术交流与讨论，仅供参考不构成任何学术建议。
