1、4实验一 准备实验（一）分光光度计的使用一. 目的通过电化教学方式学习分光光度计的工作原理掌握比色测定的基本操作方法二. 原理光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在 400750nm：小于 400nm 的光线称为紫外光；大于 750nm 的光线称为红外光。当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过、因此光线射出溶液之后，部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。分光光度法依据 Lambert-Beer 定律： = KCLI0lg令 A = ，T = ，则 A = KCL，A = -lgTI0lg0I其中：T：透
2、光率 A：吸光度（有时用光密度 OD 表示）I： 透射光强度 I0：入射光强度K：吸收系数 L：溶液的光径长度C：溶液的浓度从上式可以看出，一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部分，其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比，当入射光、吸收系数 K 和溶液的光径长度 L 不变I0 ICL5时，吸光度 A 与溶液的浓度 C 成正比。三. 实验材料及设备1. 仪器分光光度计 放相机 电视机2. 器材普通试管： 20mL3移 液 管： 5mL2烧 杯： 250mL1洗 耳 球： 2洗瓶、试管架、移液管架：各 1四. 试剂的配制重铬酸钾（K 2Cr2O7）溶液（ 0.2mg/mL）称取 0.2g K2
3、Cr2O7，蒸馏水溶解后定容至 1000mL。五. 操作步骤1. 在电教室中看录像了解 721 型分光光度计的工作原理。2. 在分光光度室中练习操作详细步骤见附录六。3. 在实验室中应用练习取 3 支试管，按下表所示顺序操作。空白 样品管号操作 0 重铬酸钾溶液(mL) 5.0 5.0蒸馏水 (mL) 5.0比色 以 0 号管为空白参比，测定=450nm 处的吸光度记录吸光度（A 450）6六. 结果处理1. 求两个样品管 A450 的平均值 450； A2. 计算重铬酸钾的摩尔消光系数。七. 思考题1. 到分光光度室中进行比色测定应携带哪些器材？它们分别起什么作用？2. 比色时，设一个“0”
4、号管的意义是什么？7实验二 3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量一. 目的了解 3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的原理掌握总糖定量测定的操作方法二. 原理还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖）和某些具有还原性的双糖（如麦芽糖） 。它们在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。遇氧化剂时，具有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。黄色的 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为 540nm 处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的
5、含量。对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉） ，应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量，当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以折算系数（1-COHOHNO2O2N- COHOHO2N NH23,5- 3-5-CCHOOHOHCHCH2OHOH( )n ( )nCHCOHOHCHCH2OHOH 8= 0.9） ，即得比较接近实际的样品中总糖含量。180三. 实验材料及设备1. 材料面粉2. 仪器分光光度计 电子天平 沸水浴3. 器材刻
6、度试管： 25mL8容 量 瓶： 100mL2锥 形 瓶： 100mL1移 液 管： 1mL2 2mL2 10mL2烧 杯： 250mL1 50mL1滴 管： 2洗 耳 球： 2滤 纸： 11cm坐 标 纸漏斗、洗瓶、白瓷板、试管架、移液管架、试管夹、玻棒：各 1四. 试剂的配制1. 葡萄糖标准液（1mg/mL ）预先将分析纯葡萄糖置 80烘箱内约 12 小时。准确称取 500mg 葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至 500mL 容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中 4保存期约一星期） 。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。2. 3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS 试剂）将 5.0g
7、 3,5-二硝基水杨酸溶于 200mL 2N NaOH 溶液中（不适宜用高温促溶） ，接着加入 500mL 含 130g 酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至 1000mL。暗处保存备用。3. 碘液称取 5g 碘和 10g 碘化钾，溶于 100mL 水中。94. 酚酞指示剂称取 0.1g 酚酞，溶于 250mL 70%（V/V ）的乙醇中。5. HCl 溶液（ 6N）取 500mL12NHCl，用水稀释至 1000mL。6. NaOH 溶液（6N）取 240gNaOH，加水溶解，定容至 1000mL。五. 操作步骤1. 样品中总糖的提取(1) 取材
8、：称取 0.7g 面粉，准确记录实际质量（W） ，放入 100mL 锥形瓶中。(2) 溶解：先用几滴蒸馏水调成糊状；加入 15mL 蒸馏水；再加入 10mL 6N HCl，搅匀。(3) 水解：置于沸水浴中水解 30 分钟。用玻璃棒取一滴水解液于白瓷板中，加 1 滴碘液，检查淀粉水解程度。如显蓝色，表明未水解完全，应继续水解。如已水解完全，则不显蓝色，可以取出沸水浴中的锥形瓶，冷却。(4) 中和：加 1 滴酚酞指示剂，加入 10mL 6N NaOH 中和至微红色。(5) 定容：将溶液转移至 100mL 容量瓶（B 1）中，定容。(6) 过滤：用滤纸过滤。 （注意，滤纸不能用蒸馏水湿润。 ）(7)
9、 稀释：精确吸取滤液 10mL，移入另一个 100mL 容量瓶（B 2）中，定容。 （B 2）液作为总糖待测液备用。2. 标准曲线制作及样品测定取 8 支 25mL 刻度试管，按下表所示顺序操作。空白 标准葡萄糖浓度梯度 样品管号操作 0 1 2 3 4 5 葡萄糖标准液(mL) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0样品待测液(mL) 1.0 1.0蒸馏水(mL) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 1.0 1.0DNS 试剂(mL) 各 2.0反应 各管混匀，沸水浴 5 分钟定容 冷却；分别用蒸馏水定容至 25mL比色 以 0 号管为空白参比，测定=540nm 处的吸光度记录吸
10、光度（A 540）10六. 结果处理1. 由 05 号管的数据，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，A 540 为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；2. 求两个样品管 A540 的平均值 540； A3. 由 540 从标准曲线中求样品管中葡萄糖的含量 (mg)； A4. 计算你所取的生物材料中总糖的百分含量。七. 思考题1. 在样品的总糖提取时，为什么要用浓 HCl 处理？而在其测定前，又为何要用 NaOH中和？2. 标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么要同步进行？ 11实验三 Folin-酚比色法测定蛋白质含量一. 目的学习 Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法二. 原理Folin-酚
11、法，又名 Lowry 法，所用的试剂由两部分组成：试剂甲为碱性硫酸铜溶液，相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中肽键起双缩脲反应，生成 Cu2+-蛋白质络合物；试剂乙为磷钨酸- 磷钼酸混合物，在碱性条件下极不稳定，易被上述络合物以及酪氨酸和色氨酸残基还原成钨蓝和钼蓝。在一定蛋白质浓度范围内，钨蓝和钼蓝在 500nm 波长处的光吸收与蛋白质含量成正比，以此可测定蛋白质的含量。该方法灵敏度高，测定范围为 25g250g，比双缩脲法灵敏 100 倍，用作一般浓度的测定较为适宜，且操作简便、快速，所以是一般实验室中经常使用的方法之一。注意，酚类物质、柠檬酸、甘氨酸、EDTA、各种糖以及各种还原剂等对测定均有干
12、扰作用。三. 实验材料及设备1. 材料绿豆芽2. 仪器分光光度计 电子天平3. 器材普通试管： 20mL8容 量 瓶： 100mL1移 液 管： 1mL4 5mL1烧 杯： 250mL1 50mL1滤 纸： 11cm滴 管： 2洗 耳 球： 2坐 标 纸12研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各 1四. 试剂的配制1. 牛血清白蛋白标准液（250g/mL）精确称取 0.0250g 牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至 100mL。2. Folin-酚试剂甲 溶液 A：Na 2CO3 10gNaOH 2g 用蒸馏水溶解后定容至 500mL；酒石酸钾钠 0.25g 溶液 B：CuSO 45H2
13、O 0.05g 用蒸馏水溶解后定容至 10mL； 使用前，将溶液 A 和溶液 B 以 50:1 相混合。该混合液只能保持一天。3. Folin-酚试剂乙 在 1500mL 容积的磨口烧瓶中，加入 100g 钨酸钠(Na 2WO42H2O)、25g 钼酸钠(NaMoO42H2O)及 700mL 蒸馏水，再加入 50mL 85%正磷酸和 100mL 浓盐酸，充分混合后，接上回流冷凝管，以小火回流 10 小时。 回流结束后，趁热加入 150g 硫酸锂、50mL 蒸馏水及数滴液体溴，再继续开口沸腾 15 分钟，以驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色。（若仍呈绿色，须重复滴加液体溴，再沸腾 15 分钟，直至呈
14、黄色。 ） 用蒸馏水定容到 1000mL；过滤；用棕色试剂瓶保存。 使用前稀释 1 倍，使其最终浓度相当于 1N 酸。五. 操作步骤1. 样品液的制备(1) 取材：称取新鲜绿豆芽下胚轴 2g 左右，准确记录其质量。(2) 研磨：将取得的材料置于研钵中，研磨成匀浆。(3) 过滤：将匀浆转移至垫有滤纸的漏斗中过滤，收集滤液；用约 10mL 蒸馏水分三次洗涤研钵，洗涤液也过滤并收集其滤液。(4) 定容：将滤液用蒸馏水定容到 100mL，作为样品待测液。2. 标准曲线制作及样品测定取 8 支试管，按下表所示顺序操作。13空白 标准蛋白浓度梯度 样品管号操作 0 1 2 3 4 5 牛血清白蛋白标准液(
15、mL) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0样品待测液(mL) 1.0 1.0蒸馏水(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2Folin-酚试剂甲 各 5.0mL反应 各管混匀，室温下放置 10 分钟Folin-酚试剂乙 各 0.5mL反应 及时混匀，室温下放置 30 分钟比色 以 0 号管为空白参比，测定=500nm 处的吸光度记录吸光度（A 500）六. 结果处理1. 由 05 号管的数据，以蛋白质含量(g) 为横坐标，A 500 为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；2. 求两个样品管 A500 的平均值 500； A3. 由 500 从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量 (g)； A
16、4. 计算你所取生物材料中蛋白质的百分含量。七. 思考题1. 某蛋白质样品中酪氨酸含量高于牛血清白蛋白中的酪氨酸含量，应用本方法测得的值与实际值相比，是偏高还是偏低？为什么？2. 加入 Folin-酚试剂乙后，为什么须迅速混匀？3. 标准蛋白质浓度梯度和样品蛋白质含量的测定为什么要同步进行？14实验四 RNA 的提取与核酸的颜色反应一. 目的学习用浓盐法从酵母中提取 RNA掌握用等电点法沉淀 RNA观察核酸的颜色反应，了解核酸定性与定量测定的原理熟练掌握普通离心机的使用方法二. 原理酵母繁殖快，生长周期短；其细胞质中的核酸大部分是 RNA，而 DNA 很少；RNA 提取液与菌体分离比较容易。因
17、此，酵母是提取 RNA 的好材料。将 RNA 从细胞中释放出来在工业上主要有三种方法稀碱法、浓盐法和自溶法。本实验采用浓盐法，即利用高浓度的盐（10% NaCl）在 90100C 条件下改变了细胞膜通透性，并将核蛋白体解离成 RNA 和蛋白质而使 RNA 释放到盐溶液中。同时，90100 C 的高温可破坏磷酸单酯酶和磷酸二酯酶的活力，避免 RNA 的降解。注意，在 3070 C 时这两种酯酶的作用活跃，提取时应避免在此温度范围内停留时间过长。由于核膜内的 DNA 分子量较大，穿越膜孔较困难，一般不易释放到菌体外面，所以采用离心技术，可使 RNA 溶液与菌体残渣以及 DNA 分离。根据核酸在等电
18、点溶解度最小的性质，将溶液在低温下调 pH 至 2.02.5，RNA以白色絮状沉淀形式从盐溶液中析出。再次离心，固液分离，便可获得 RNA 粗产品。最后用乙醇洗涤沉淀，溶解和去除脂溶性杂质和色素以及盐分杂质。由于 RNA 不溶于乙醇，所以用乙醇洗涤还可以使 RNA 沉淀物脱水，变得疏松，便于干燥，提高了RNA 产品的纯度。DNA 和 RNA 的鉴别，较常用的方法是利用两类核酸中不同的戊糖各自具备的不同的颜色反应，而得以定性鉴别。其中鉴定 DNA 的方法称为二苯胺法，鉴定 RNA 的方法称为地衣酚（苔黑酚，3,5- 二羟甲苯）法。具体反应式如下：OHOCH2 OHHOHOHHHH H+,-2H2
19、O OCHOOHOH CH3FeCl3H+, (670nm)RNA15上述颜色反应不但可用于两类核酸的定性鉴别，也是定糖法定量测定核酸的依据。关于离心机的使用原理和方法，详见附录。三. 实验材料及设备1. 材料干酵母2. 仪器离心机 电子天平 沸水浴 烘箱 抽滤装置 冰浴3. 器材普通试管： 20mL4（干燥）锥 形 瓶： 100mL1量 筒： 50mL1移 液 管： 1mL2烧 杯： 250mL1 100mL1 50mL1离 心 管： 100mL1温 度 计： 501表 面 皿： 9cm滴 管： 2洗 耳 球： 2加 样 器pH 试纸： pH0.55.0滤 纸： 7cm洗瓶、试管架、移液管架
20、、试管夹、玻棒：各 1OHOCH2 OHHOHHHH H+,-H2ODNAH CH2 CHOOOHCCH2CH2NHH+, (595nm)-r-16四. 试剂的配制1. NaCl 溶液（C.P.） （10% ）2. HCl 溶液（ 6N）取 500mL 浓盐酸，用水稀释至 1000mL。3. 乙醇（C.P.） （95%）4. 苔黑酚试剂（又称地衣酚试剂）将 200mg 苔黑酚溶于 100mL 浓盐酸中，再加入 100mg FeCl36H2O。（低温贮藏一周）5. 二苯胺试剂将 1g 二苯胺溶于 98mL 冰醋酸中，再加入 2mL 浓硫酸（比重 1.84） 。（临用时配制，用前可加几滴乙醛。 ）
21、五. 操作步骤1. 取材在天平上准确称取干酵母 3.00g，转移至 100mL 锥形瓶中。2. 浓盐浸提取 27mL 10%NaCl 溶液，加入到含干酵母的锥形瓶中，搅拌均匀；置于90100 C 水浴中，浸提 30 60 分钟；冷却。3. 离心将锥形瓶中提取液和沉淀全部转移至 100mL 离心管中，取 10mL H2O 洗涤锥形瓶，并入离心管中；平衡后以 4000 转/分钟离心 15 分钟；将上清液（即 RNA 提取液）倾入 50mL 烧杯中，弃去沉淀（菌体残渣） 。4. 沉淀 RNA(1) 冷却：将 50mL 烧杯置于放有冰块的 250mL 烧杯中冷却；将温度计插入 50mL 烧杯中，待溶液
22、冷至 10C 以下时，取出温度计。(2) 调 pI：缓慢滴加 6NHCl 于 50mL 烧杯中，用玻棒一边轻轻搅拌溶液，一边测量pH 值，调节溶液 pH 至 2.02.5 范围，溶液中白色沉淀逐渐增多，到等电点时沉淀量最多；继续在冰浴中静止 15 分钟，使沉淀充分。（注意：严格控制 pH；若搅拌过快核酸难以凝聚沉淀。 ）5. 离心将小烧杯中溶液和沉淀移至离心管中，再次平衡、离心（4000 转/分钟，15 分17钟） ；弃去上清液，保留 RNA 沉淀。6. 洗涤与抽滤(1) 洗涤：取 10mL 95%乙醇加到含 RNA 沉淀的离心管中，悬浮沉淀，浸泡分钟。(2) 抽滤：取大小合适的滤纸，先在数字
23、显示天平上称重；然后放入布氏漏斗中，用少量乙醇湿润滤纸，开启真空泵，使滤纸贴紧漏斗，将沉淀及溶液全部转移至布氏漏斗内；再用 15mL 95%的乙醇洗涤离心管，淋洗滤渣。7. 干燥用小镊子取出布氏漏斗中的沉淀物和滤纸，转移至表面皿上，置于 80C 烘箱内干燥。8. 称重取出样品，在室温下冷却数分钟后，将沉淀物及滤纸置于数字显示天平上称重。9. 颜色反应(1) 溶解：取 50mL 水溶解 RNA 沉淀，同时加 2 滴 NaOH 助溶。(2) 颜色反应：取支洁净、干燥的试管，按下表所示顺序操作。管号操作 1 2 3 4RNA 稀释液（mL） 0.5 0.5蒸馏水（mL） 1 0.5 1 0.5苔黑酚
24、试剂（mL） 2 2二苯胺试剂（mL） 2 2反应 在通风橱内，沸水浴 10 分钟颜色六. 结果处理1. 写出核酸产品的颜色和外形。2. 计算 RNA 的粗产品的得率。3. 由颜色反应的结果，说明产品中含有核酸的情况。七. 思考题1. 在实验中用了哪些试剂？它们各起什么作用？182. 实验中两次离心，每次离心后应保留上清液，还是沉淀？为什么？19实验五 影响唾液淀粉酶活性的一些因素一. 目的了解温度对酶活性的影响了解 pH 对酶活性的影响了解激活剂和抑制剂对酶活性的影响二. 原理酶的催化活性受温度的影响很大。酶反应在低温时进行较慢，随着温度升高而加快，当达到其最适温度时，酶反应速度最快，以后又
25、随着温度升高而减慢，以至完全停止反应。人的唾液淀粉酶活性随着温度的升高而升高，直到 37左右，温度更高时酶的活性则下降。通常，测定酶的活力时，在酶反应的最适温度下进行。应当指出，一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用的时间长短有关，一般作用时间长，最适温度低，而作用时间短，则最适温度高。动物酶的最适温度一般为 3540，而植物酶的最适温度较高，在 4050之间。酶的活性受环境 pH 的影响极为显著。通常，各种酶只有在一定的 pH 范围内才表现它的活性。一种酶表现其活性最高时的 pH 值，称为该酶的最适 pH。低于或高于最适 pH 时，酶的活性逐渐降低。人的唾液淀粉酶在 pH3.89.4 之间
26、表现其活性，最适pH 约为 6.8。不同酶的最适 pH 值不同。然而，酶的最适 pH 受底物性质和缓冲液性质的影响。例如，唾液淀粉酶在醋酸缓冲液中的最适 pH 不是 6.8，而为 5.6。酶的活性常常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂；有些物质能使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。Cl -是唾液淀粉酶的激活剂。其它的阴离子，如 Br-、NO 3-和 I- 对该酶也有激活作用，但较微弱。而 Cu2+对唾液淀粉酶具有抑制作用。激活剂和抑制剂影响酶活性的剂量是很少的，并且常具有特异性。在本实验中，以稀释的唾液作为淀粉酶液。唾液内的淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小的糊精分子，最
27、终产物为麦芽糖和少量的葡萄糖。它们遇碘呈不同的颜色。直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈蓝色；糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不显颜色：淀粉 紫色糊精 红色糊精 麦芽糖及少量葡萄糖与 I2 呈蓝色 与 I2 呈紫色 与 I2 呈红色 与 I2 不显色由于在不同温度，不同 pH，或者在有激活剂或抑制剂存在的条件下唾液淀粉酶的活性高低不同，则淀粉被水解的程度不同，所以，可由酶反应混合物遇碘所呈现的颜色来判断，从而可了解上述诸因素对酶活性的影响。但需注意在碱性条件下碘会发生20歧化反应，部分碘形成无色的碘酸盐、次碘酸盐，此时应增加碘液加入量。三. 实验材料
28、及设备1. 材料唾液2. 仪器恒温水浴 沸水浴 冰浴3. 器材普通试管： 20mL8容 量 瓶： 100mL1移 液 管： 1mL4 2mL3 5mL1烧 杯： 250mL1 50mL1温 度 计： 1滴 管： 2洗 耳 球： 2漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各 1四. 试剂的配制1. 淀粉溶液（0.5%）称取 5g 可溶性淀粉，溶于 1000mL 热水中。 （临用前配制）2. NaCl 溶液（0.3%）3. CuSO4 溶液（ 0.3%）4. 碘液称取 2g 碘和 3g 碘化钾溶于 100mL 水中。临用前稀释 10 倍。5. 磷酸缓冲溶液系列（0.2mol/L）：pH4.8、pH6.
29、8、pH9.8五. 操作步骤1. 唾液淀粉酶的制备(1) 提取：实验者先用水漱口清洁口腔，然后含一小口（约 5mL）蒸馏水于口中轻嗽一、二分钟。21(2) 稀释：将酶提取液用水定容至 100mL。作为唾液淀粉酶的样品液。（由于不同人或同一人不同时间收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀释倍数可以是 50300 倍，甚至超过此范围。 ）2. 温度对唾液淀粉酶活性的影响取 8 支试管，编号，按表一操作，并记录观察到的颜色。表一管 号操 作 A a B b C c D dpH6.8 缓冲液（mL） 1 1 1 1NaCl 溶液（mL） 1 1 1 1淀粉溶液（mL） 5 5 5 5淀粉酶液（mL） 1
30、 1 1 1预保温(10 分钟) 冰浴 室温( ) 37 沸水浴混合 A 倒入 a 中 B 倒入 b 中 C 倒入 c 中 D 倒入 d 中酶促反应(10 分钟) 冰浴 室温 37 沸水浴碘液 各 1 滴 （d 管应先冷却至室温）颜色3. pH 对唾液淀粉酶活性的影响取 3 支试管，编号，按表二操作，并记录观察到的颜色。表二管 号操 作 缓冲液（mL） 2（pH4.8） 2（pH6.8） 2（pH9.8 ）NaCl 溶液（ mL） 各 1淀粉溶液（mL） 各 5淀粉酶液（mL） 各 1酶促反应 摇匀，37水浴 10 分钟碘液 1 滴 1 滴 3 滴颜色224. 激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性的
31、影响取 3 支试管，编号，按表三操作，并记录观察到的颜色。表三管 号操 作 pH6.8 缓冲液（mL ） 各 2NaCl 溶液（ mL） 1CuSO4 溶液（mL） 1H2O 1淀粉溶液（mL） 各 5淀粉酶液（mL） 各 1酶促反应 摇匀，37水浴 10 分钟碘液 各 1 滴颜色六. 结果处理1. 分析表一的结果，并作出温度对唾液淀粉酶活性影响的示意图。2. 分析表二的结果，并作出 pH 对唾液淀粉酶活性影响的示意图。3. 分析表三的实验结果。七. 思考题1. 什么是酶的最适温度？有何实践意义？2. 什么是酶的最适 pH？它是否是一个常数？它与哪些因素有关？这种性质对于选择测定酶活力的条件有
32、什么意义？3. 酶反应的抑制作用有哪些类型？各根据什么划分的？它们各有什么特点？23实验六 淀粉酶的活力测定及专一性实验一. 目的了解淀粉酶对不同底物的专一性掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法二. 原理酶与一般催化剂最主要的区别之一是它具有高度的专一性。所谓专一性指的是一种酶只能对一种化合物或一类化合物（通常在这些化合物的结构中具有相同的化学键）起一定的催化作用，而不能对别的物质发生催化反应。例如，淀粉酶只作用于淀粉中的 -1,4 葡萄糖苷键，而不能作用于蔗糖分子中-D-吡喃葡萄糖的 C1 和-D-呋喃果糖的 C2 之间的糖苷键。蔗糖无还原性，淀粉的还原性也极小，它们对 3,5-二硝基水杨酸试
33、剂（DNS 试剂）呈阴性反应，而唾液淀粉酶（主要含- 淀粉酶）水解淀粉后的产物则为还原性糖，与DNS 试剂共热呈阳性反应，产生红棕色。据此可以检验蔗糖和淀粉有无被唾液淀粉酶水解，从而了解酶作用的专一性。酶活力也称酶活性，是以酶在最适温度、最适 pH 等条件下，催化一定的化学反应的初速度来表示。本实验是以一定量的唾液淀粉酶液，于 37C、pH6.8 的条件下，在一定的初始作用时间里将淀粉转化为还原糖，然后通过与 DNS 试剂作用，比色测定，求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力。这里规定，一个淀粉酶活力单位定义为在 37C、pH6.8 的条件下，每分钟水解淀粉生成 1mg 还原
34、糖所需的酶量。三. 实验材料及设备1. 材料唾液2. 仪器分光光度计 恒温水浴 沸水浴3. 器材刻度试管： 25mL10容 量 瓶： 100mL1移 液 管： 1mL4 2mL224烧 杯： 250mL1滴 管： 2洗 耳 球： 2洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各 1四. 试剂的配制1. 淀粉溶液（0.5%）称取 5g 可溶性淀粉，溶于 1000mL 热水中。 （临用前配制）2. 蔗糖溶液（1% ）3. 3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS 试剂）将 5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于 200mL 2N NaOH 溶液中（不适宜用高温促溶） ，接着加入 500mL 含 130g 酒石酸钾钠的溶液，
35、混匀。再加入 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至 1000mL。暗处保存备用。4. 磷酸缓冲液（0.2mol/L ，pH6.8）5. NaOH 溶液（6mol/L）6. NaCl 溶液（0.3%）五. 操作步骤1. 唾液淀粉酶的制备(1) 提取：实验者先用水漱口清洁口腔，然后含一小口（约 5mL）蒸馏水于口中轻嗽一、二分钟。(2) 过滤：将口腔中的酶提取液用一层脱脂棉过滤。(3) 稀释：取滤液 1mL，用水定容至 100mL。作为淀粉酶的样品液。（由于不同人或同一人不同时间收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀释倍数可以是 50300 倍，甚至超过此范围。 ）2. 唾液淀粉酶的专
36、一性实验取 4 支试管，按表一编号并操作，记录所观察到的颜色。25表一管 号操 作 pH6.8 缓冲液（mL） 1 2 1 2蔗糖溶液（mL） 1 1淀粉溶液（mL） 1 1淀粉酶液（mL） 1 1酶促反应 摇匀，37水浴 5 分钟DNS 试剂（ mL） 各 2显色反应 沸水浴 5 分钟颜色3. 唾液淀粉酶活力的测定取 25mL 刻度试管 5 支，按表二编号并操作，记录实验结果。表二空白 0 时刻 5 分钟时刻管号操作 0 A1 A2 B1 B2淀粉酶液（mL） 各 1pH6.8 缓冲液（mL） 各 1NaCl 溶液（ mL） 各 1预热 摇匀，37水浴 2 分钟6N NaOH 溶液（mL）
37、1 1预热的淀粉溶液（mL） 1 1 1 1蒸馏水（mL） 1酶促反应 摇匀，37水浴 5 分钟（准确计时）6N NaOH 溶液（mL） 1 1 1DNS 试剂（mL） 各 2显色反应 摇匀，沸水浴 5 分钟，冷却，各用水定容至 25mL比色 以 0 号管为空白参比，测定=540nm 处的吸光度记录吸光度（A 540）26六. 结果处理1. 解释表一的实验结果。2. 根据表二的实验结果，并利用实验四“3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量”中制作的标准曲线，计算每毫升新鲜唾液含有淀粉酶的活力单位。七. 思考题1. 在测定酶活力时应注意哪些反应条件？为什么？2. 淀粉酶的比活力单位可以怎样表示？
38、你将采取什么方法求得？27CHCHCl2CH2O实验七 葡聚糖凝胶层析脱盐一. 目的学习凝胶层析的工作原理和操作方法掌握利用葡聚糖凝胶层析进行蛋白质脱盐的技术二. 原理凝胶层析又称凝胶过滤或排阻层析。凝胶过滤的主要装置是填充有层析介质的层析柱。1. 层析介质的特点（1）遇水为不溶解的固相； （2）是化学惰性物质；（3）离子基团含量少； （4）颗粒大小和网眼均匀；（5）机械强度较强； （6）具有可选择的多种孔径。目前使用较多的是葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶及其衍生物。尤其葡聚糖凝胶（商品名称 Sephadex）是最常用的层析介质。它是由一定平均分子量的葡聚糖和交联剂 1-氯-2,3-环
39、氧丙烷（ ）交联成的具有三维结构不溶于水的高分子化合物。调节葡聚糖和交联剂配比，可以获得网眼大小不同，型号各异的凝胶。当葡聚糖分子量越小，交联剂用量越大，则交联度越大，凝胶网眼越小，吸水量越小，G 值也越小。G 值表示每克干胶吸水量（mL）的十倍。例如 Sephadex G-25 其吸水量应为 2.5mL/g 干胶。常用的葡聚糖凝胶有多种规格，如 G-10、G-15、G-25 、G-50、G-75 、G-100 等。实验中选用何种型号应根据被分离的混合物分子的大小及工作目的来确定（参见附录五） 。2. 分离原理当混合样液加到凝胶柱上，随着洗脱剂而通过凝胶柱时，分子大小不同的物质受到不同的阻滞作
40、用。颗粒接近或大于网眼的分子，不能进入凝胶的网眼中，在重力作用下它们随着溶剂在凝胶颗粒之间沿较短流程向下流动，受到的阻滞作用小，移动速度快，先出层析柱（此现象叫作被排阻。被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限） ；而颗粒小于网眼的分子可渗入凝胶网眼之中，它们被洗脱时不断地从一个网眼穿到另一个网眼，逐层扩散，阻滞作用大，流程长，移动速度慢，因而后出层析柱。在层析柱的出口处，我们用多个试管分步收集洗脱液，就可将混合物中各组分彼此分离。28当我们从生物组织中用盐析法提取蛋白质后，常需要进行蛋白质的脱盐工作，我们可采用层析介质为葡聚糖凝胶 G-25（或 G-15、G-50） ，用适当的洗脱剂进行洗
41、脱，经凝胶层析，就可以将大分子蛋白质与小分子盐类分离。三. 实验材料及设备1. 材料含硫酸铵盐的蛋白质溶液（参见附注）2. 器材层 析 柱： 内径柱高=1.0cm25cm滴定台架、螺丝夹：各 1刻度试管： 10mL14移 液 管： 1mL1烧 杯： 250mL1 50mL1滴 管： 2洗 耳 球： 2洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各 1四. 试剂的配制1. 葡聚糖凝胶-25(或 G-15、G-50)溶胀凝胶方法：按每个层析柱约 4g 的量称取葡聚糖凝胶 G-25 于烧杯中，加过量蒸馏水于沸水浴中溶胀 2 小时或在室温下溶胀 6 小时以上。用倾泻法除去上层漂浮的细碎凝胶，重复 34 次。操作中避
42、免剧烈搅拌，防止破坏其交联结构。2. BaCl2 溶液（1%）3. 考马斯亮蓝 G-250称取 0.1g 考马斯亮蓝 G-250，先溶于 50mL95%乙醇中，再加入 85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到 1000mL。暗处存放。4. 脲（6mol/L）5. 洗脱剂应依据被纯化的蛋白质的不同特性而选用不同的缓冲液。29五. 操作步骤1. 层析柱的准备(1) 清洗：每组取一支层析柱，用清水冲洗干净。（若玻璃柱较脏，应卸去塑料装置，先入洗液中浸泡 2 小时。 ）(2) 安装与检查：检查出口装置中尼龙绸或烧结滤板是否完好干净。安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处，放一只 250mL
43、 烧杯。向层析柱内灌洗脱剂，打开出口螺旋夹，检查有无渗漏、出口乳胶管是否通畅等情况。(3) 排气泡：保持柱内一定的水位，用手指弹击柱壁，部分气泡会从溶液中上浮排出。出口处的小气泡易停留在螺旋夹附近的乳胶管内，要想法排尽，否则会影响分离结果，排气完毕，保留柱内 12cm 高水位，关紧螺旋夹。(4) 标记高度：在距顶端 810cm 处做一标记，作为衡量灌装层析介质床体高度（1517cm）的依据。2. 装柱每组用 50mL 烧杯取溶胀的凝胶悬浆 2530mL ，静置片刻，观察凝胶沉淀与水的体积之比，约为 1:1 即可，否则应作调整。轻轻搅匀杯中凝胶，用玻璃棒引流入柱，打开出水口，并不断地向柱内补充凝
44、胶，直到凝胶沉淀高度位于标记上方约 2cm 为止，凝胶柱内若有气泡和断层或柱床表面干水和歪斜，都将影响分离效果。必要时，需倒出凝胶，重新装柱。3. 平衡取 15mL 洗脱剂，用滴管沿柱内壁旋转着缓缓流下，不可冲动胶平面，打开出水口，经洗脱液的流动，一方面清洗内壁，另一方面使胶床收紧。洗脱平衡完毕，胶床上方保留约 4cm 高水位，关闭出水口。此时，胶床高度15cm 为宜。4. 准备收集取 6 只干净的刻度试管（除净试管内残留的水） ，16 编号，并在试管 2mL处作一标记，插入试管架上，为收集洗脱样品作好准备。5. 上样与收集打开出口排水，当胶床与上方水层的弯月面相切时，关闭出口，用滴管将0.2
45、mL 混合样液沿柱内壁缓缓加入，勿冲动胶面。上样完毕，打开出水口，开始收集一号管。每管收集洗脱液 2mL。当样液进入胶床，其弯月面与胶平面相切时，暂停排液，用滴管将洗脱剂沿柱内壁旋转着加入 1cm 高水位，然后排液，至其弯月面与胶平面相切，再缓缓注入 35cm 高的洗脱剂。306. 洗脱不断向柱内加洗脱剂，保持胶床上水位 35cm。出口流速控制在每 6 秒 1 滴，直至收集到 6 号管达 2mL 时，关闭出口。7. 鉴定另取 6 只干净试管，按收集顺序将洗脱液一分为二，即每管 1mL，依次在试管架上排成二排。第一排每管加 2 滴 BaCl2，根据白色沉淀多少，判断 SO42-在各管中的浓度。第
46、二排每管加 1mL 考马斯亮蓝 G-250 试剂，根据蓝色情况，判断蛋白质在各管中的浓度。将结果记录于下表中。若鉴定的第 6 号管中，仍有样品，表明洗脱和收集不够，需增加 7 号、8号试管继续洗脱与收集，同上法鉴定其蛋白质和盐浓度情况。管 号项 目 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11白色沉淀量蓝色深浅8. 再生鉴定完毕，打开出水口，继续用倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。六. 结果处理1. 根据实验结果，在同一坐标系中，以收集的管号为横坐标，颜色深浅程度为纵坐标，绘制二条（蛋白质及(NH 4)2SO4）洗脱曲线。2. 分析混合样品分离效果。七. 思考题1. 利用凝胶
47、层析分离混合物时，怎样才能得到较好的分离效果？2. 还有哪些方法可进行蛋白质脱盐？31附注1. 凝胶的再生通常层析柱经洗脱剂再生、平衡后，就可反复使用。但使用过多次后凝胶床体积变小，流速降低，凝胶污染 杂质过多，甚至变色，需 经再生后才可使用。再生方法有多种：如（1）用水进行逆向冲洗，再用洗脱 剂平衡，便可重新使用。又如（2）把凝胶倒出，用 6mol/L 脲浸泡凝胶半小 时，抽滤，再用水漂洗数次，除净脲，必要时重复上述操作即可重新使用。2. 凝胶的保存(1) 湿法保存，可保存几个月至一年，有多种方法： 加入防腐剂硫柳汞，使其浓度为 0.005%，下次使用前，水洗除去硫柳汞。 加入几滴氯仿，摇匀
48、存放。下次使用前用热水浴除去氯仿。 （沸点 60）。 凝胶保存在 6070%乙醇溶液中，即凝胶以部分收 缩状 态保存。(2) 干法保存此法操作不及湿法简便，但处 理得好，凝胶存放 时间长。先抽取过量水分，再向凝胶逐步加入百分浓度递增的乙醇溶液，每次停留一段时间，使凝胶逐步脱水，最后加入 95%乙醇，凝胶脱手收缩。抽干， 铺与搪瓷盆中，6080 经 常翻动烘烤。若有 结块 ，在下次膨胀时会散开的，不可用力敲碎，否则会破坏颗粒结构。3. 用盐析法分离提取麦清蛋白取 10g 小麦种子，粉碎。转入 250mL 具塞磨口锥形瓶中。加 100mL 蒸馏水，在康氏震荡器上震荡 1 小时。静置半小 时，上清液以 3000 转 /分钟离心 15 分钟。将上清液在布氏漏斗上（铺 34 层滤纸）抽滤。滤液应透明。用醋酸酸化滤液至 pH4.7。加等体积的饱和硫酸铵溶液， 边加边搅动，即有白色絮状沉淀生成。置冰箱 过夜，使麦清蛋白全部盐析沉淀出来，以 3000 转/ 分钟离心 20 分钟 ，弃去上清夜，加 10mL无离子水使沉淀溶解，即得麦清蛋白和硫酸铵的混合液。32实验八 自选开放实验1. 钼酸铵比色法测定 Vc 的含量2. 2,6-二氯酚靛酚测定 Vc 的含量3. DNA 与 RNA 的提取分
