1、实验一 常用器皿包扎与培养基的配制和灭菌一、实验目的1 学会常用器皿包扎方法2 学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤3 学会实验室灭菌锅的使用方法二、常用器具和仪器试管（test tube） ，德汉氏小管（Durham tube） ，玻璃吸管（glass pipette） ，吸器，微量加样器（micropipette ） ，吸嘴（ tip） ，培养皿（petri dish） ，三角瓶（erlenmeyer flask） ，接种铲（inoculating shovel） ，玻璃涂布器（glass spreader） ，接种环（inoculating loop） ，接种钩（inoculating
2、hook） ，接种针（ inoculating needle） ，小塑料离心管（Eppendorf tube） ，滴瓶（dropper bottle） ，双层瓶（double bottle） ，酒精灯(alcohol burner） ，煤气喷头（coal gas sprinkler head） ，试剂瓶，量筒，烧杯，温度计，石棉网，漏斗，烘箱，卧式灭菌锅，手提式灭菌锅，无菌操作台/室，过滤除菌设备，厌氧操作设备，小型发酵罐，离心机，培养箱/摇床，冷冻干燥机，蒸馏水器，超声波清洗仪，磁力搅拌器。三、玻璃器皿的包装1、培养皿的包装方法一：用旧报纸密密包紧，一般以 5-8 套培养皿作一包。包好后用干
3、热或湿热灭菌（见无菌操作技术） 。方法二：将培养皿放入金属（不锈钢）筒内，干热灭菌。金属筒配有盖子，内部还有一个可以放培养皿的带底框架。框架可以从筒内提出，以便装取培养皿。包好的培养皿金属筒和内部的框架塑料培养皿架2、吸管的包装准备好干燥的吸管，在粗头端塞入一小段棉花，以免使用时将杂菌吹入或不慎将微生物吸出。将吸管尖端斜放在旧报纸的近左端，与报纸成 45角，左端多余的一段覆折在尖头上，再将整根吸管卷入报纸，右端多余的报纸打个小结。包好的吸管再用一张大报纸包好，干热灭菌。或一起装入专用吸管筒进行灭菌。如果一次可以用完，也可以将吸管直接装入筒内。尖端向内，使用时将筒平放在桌面上，手持粗端抽出。3、
4、试管和三角瓶的包装试管管口和三角瓶瓶口塞以棉花塞或泡膜塑料塞，然后在外面用两层报纸包好，并用细线扎紧。若用铝箔更好，可以不用线扎。进行干热或湿热灭菌。4、棉塞的制作：棉塞的作用主要是防止杂菌污染和保证通气良好，所以好的棉塞应该形状、大小和松紧与试管口或三角瓶口完全适合。加塞时，棉塞长度的 1/3 在管口（瓶口）外，2/3 在内。一般用纤维长的棉花做塞子，不用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水变湿，造成污染。此外，液体培养中还经常用到通气塞，即 8 层纱布重叠而成，或在两层纱布间均匀铺一层棉花作成。四、玻璃器皿的清洗新玻璃器皿：用 2 %盐酸浸泡数小时后用自来水冲洗干净；使用过的玻璃器皿：试管、培养皿、三
5、角瓶等：用瓶刷沾去污粉等洗涤剂刷洗，再用自来水冲洗干净；装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤；玻璃吸管：使用后投入有自来水的大量筒或标本缸内，以免干燥后不易清洗，再集中用自来水冲洗。载玻片和盖玻片：滴加过香柏油的玻片要先用软纸沾二甲苯擦去油，在肥皂水中煮沸5-10 min，用软布或脱脂棉擦拭后用自来水冲洗。然后在稀洗液中浸泡 2 h，再用自来水和蒸馏水冲洗晾干后浸于 95 %乙醇中备用。注意：带菌的器皿在洗涤前用 2 %煤酚皂溶液或 0.25 %新洁尔灭溶液等消毒液内浸泡 24 h 或煮沸 30 min，再洗涤；带病原菌的培养物先进行高压蒸灭菌，然后倒去培养物，再洗涤。五、培养基的配制与
6、灭菌牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：牛肉膏 3g，蛋白胨 10gNaCl 5g，琼脂 15-20g，水 1000 mL，pH 7.4-7.6 。1 称药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2 加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过
7、程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。3 调 PH：检测培养基的 PH，若 pH 偏酸，可滴加 1 滴 1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸检测，直至达到所需 pH 范围。若偏碱，则用 1mol/L HCl 进行调节。pH的调节通常放在加琼脂前。应注意 pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4 过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用 4 层纱布趁热过滤，以利结果的观察。5 分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的 15，灭菌后制成
8、斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积一半为宜。半固体培养基以试管高度的 1/4 为宜，灭菌后垂直待凝。6 加棉塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通汽的作用。要使棉塞总长约 35 塞人试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用 8 层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。7 包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。8
9、 灭菌：将上述培养基于 121.3湿热灭菌 20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放人冰箱内暂存。9 摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜度的长度不超过试管总长度的 1/2。10 无菌检查：将灭菌的培养基放入 37温箱中培养 24-48h，无菌生长即可使用。或储存于冰箱清洁的橱内，备用。六、实验任务每人：包扎 4 个平皿、2 只吸管；2 支装有 9 ml 的无菌水的试管做 2 个试管塞、做 1 个三角瓶塞子并包扎好；做一支斜面。每小组（两人一组）：包扎三角玻璃棒 1 支，配制 200 mL 培养基六、思考题1、配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应
10、注意些什么问题?为什么?答：称药品、加热溶解、调 pH、过滤、分装、加棉塞、包扎、灭菌、摆斜面、无菌检查注意问题：称药品用的各药匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖，瓶盖切莫张冠李戴；调节 pH 时要小心操作，尽量避免回调而带入过多的金属离子；加热融化过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分；配制好的培养基如因特殊情况不能及时灭菌，则应放人冰箱内暂存。2、培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？如何进行无菌检查。答：配制培养基的原料中有大量各种微生物存在，培养基配制好后立即灭菌是杀死所有微生物。如果不立即灭菌微生物会消耗培养基中的营养物质并产生代谢废物，从而使培养基失去其应有的营养特性或改变溶液的 pH 值。为检查灭菌后的培养基是无菌的可以将灭菌后的培养基放在 37下培养 24h，观察是否有微生物生长。3、试设计实验对饮料进行无菌检查。
