逆转录实验说明.doc

1、逆转录实验说明一、反转录酶的选择1 Money 鼠白血病病毒（MMLV ）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA 酶 H 活性相对较弱。最适作用温度为 37。2 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。最适作用温度为 42。3Thermus thermophilus、Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在 Mn2+存在下，允许高温反转录 RNA，以消除 RNA 模板的二级结构。4MMLV 反转录酶的 RNase H-突变体：商品名为 Superscript 和 SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大部分的 RNA 转换成 c

2、DNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA 模板合成较长 cDNA。二、合成 cDNA 引物的选择1 随机六聚体引物 ：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板， PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。2 Oligo(dT)：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3端 Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅 mRNA 可被转录。

3、由于 Poly(A+)RNA 仅占总 RNA 的 1-4%，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性方面均要小。3 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与 mRNA 3端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。RNA 保存：为了防止痕量 RNase 的污染，从富含 RNase 的样品（如胰脏）中分离到的 RNA 需要贮存在甲醛中以保存高质量的 RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的 RNA，在水中贮存一个

4、星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的 RNA，在水中保存 3 年仍保持稳定。另外，长度大于 4kb 的转录本对于痕量 RNase 的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存 RNA 样品的稳定性，可以将 RNA 溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解 RNA 的杂物。来源于胰脏的RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用 RNA 时，可以使用下列方法沉淀 RNA：加入 NaCl 至0.2M 及 4 倍体积的乙醇，室温放置 3-5 分钟，10,000g 离心 5 分钟。第二章 增加 RT-PCR 灵敏度分离高质量 RNA 成功的 cDNA 合成来自高质量的

5、 RNA。高质量的 RNA 至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA 或 SDS。 RNA 的质量决定了你能够转录到 cDNA 上的序列信息量的最大值。一般的 RNA 纯化方法是使用异硫氰酸胍酸性酚的一步法。Trizol 试剂法（见下图）将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解 RNA。Trizol 试剂法可以从最少 100 个细胞或 1mg 组织中提取 RNA。一般不必使用 oligo(dT)选择性分离 poly(A)+RNA。不管起始模板是总 RNA 还是 poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果（图 2）。另外，分离 poly(A)+ RNA 会导致样品

6、间 mRNA 丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有 mRNA 时，poly(A)+ RNA 会增加检测的灵敏度。 图 2. 总 RNA 和 poly(A)+ RNA 在 RT-PCR 中的比较 以 5 或 1g Hela 细胞总 RNA（分别为泳道 1 和 2）或 500ng 和 50ng Hela 细胞 poly(A)+ RNA（分别为泳道 3 和 4）。使用 oligo(dT)引物和 SuperScript逆转录酶合成 cDNA。扩增对象为 DNA 聚合酶mRNA 5端 377bp 片段和复制酶 A mRNA 的 643bp 片段，两者都为中等丰度。将 1/10

7、 的 cDNA 合成反应产物使用 Taq DNA 聚合酶扩增 30 个循环。 为了防止痕量 RNase 的污染，从富含 RNase 的样品（如胰脏）中分离到的 RNA 需要贮存在甲醛中以保存高质量的 RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的 RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的 RNA，在水中保存 3 年仍保持稳定。另外，长度大于 4kb 的转录本对于痕量RNase 的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存 RNA 样品的稳定性，可以将 RNA 溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70 。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解 RNA 的杂物。来源于胰脏的 RNA 至

8、少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用 RNA 时，可以使用下列方法沉淀 RNA：加入 NaCl 至 0.2M 及 4 倍体积的乙醇，室温放置 3-5 分钟，10,000g 离心 5 分钟。 在逆转录反应中经常加入 RNase 抑制剂以增加 cDNA 合成的长度和产量。RNase 抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如 DTT）存在的条件下加入，因为 cDNA 合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解 RNA 的 RNase。蛋白 RNase 抑制剂仅防止 RNase A，B，C 对 RNA 的降解，并不能防止皮肤上的 RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指

9、上引入 RNase。 使用无 RNaseH 活性（RNaseH- ）的逆转录酶 逆转录酶催化 RNA 转化成 cDNA。不管是 M-MLV 还是 AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH 活性。RNaseH 活性同聚合酶活性相互竞争 RNA 模板与 DNA 引物或 cDNA 延伸链间形成的杂合链，并降解 RNA：DNA 复合物中的 RNA 链。被 RNaseH 活性所降解的 RNA 模板不能再作为合成cDNA 的有效底物，降低了 cDNA 合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的 RNaseH 活性将会大有裨益。 SuperScript逆转录酶， RNaseH- 的 MML

10、V 逆转录酶及 ThermoScript 逆转录酶，RNaseH- 的 AMV，比 MMLV 和 AMV 得到更多量和更多全长的 cDNA（图 3）。RT-PCR 灵敏度会受 cDNA 合成量的影响。ThermoScript 比 AMV 的灵敏性强得多（ 图 4）。RT-PCR 产物的大小受限于逆转录酶合成 cDNA 的能力，尤其是克隆较大的 cDNA 时。同 MMLV 相比，SuperScrip显著提高了长 RT-PCR 产物的产量（图 5）。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的 37-42的温度下进行。 图 3 逆转录酶对 cDNA 第一链产量的影响 在建

11、议的合成条件下，使用 oligo(dT)引物和 10Ci 的- PdCTP。第一链的总产量使用 TCA 沉淀法计算。全长 cDNA 使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。 图 4 逆转录酶对 RT-PCR 灵敏度的影响 图 5 逆转录酶对长模板 RT-PCR 灵敏度的影响 以 oligo(dT)为引物，使用 ThermoScript或 AMV，在 50下由 Hela 细胞总 RNA 合成 cDNA。使用Platinum Taq DNA 聚合酶和人 DNA 聚合酶 引物进行 35 个循环。 人 tuberous scherosis mRNA（5.3kb）和人 DNA 聚合酶

12、mRNA 的全长 cDNA 的合成由 SuperScript和 MMLV 催化。利用oligo(dT)为引物，由 5g Hela 细胞总 RNA 合成 cDNA。样品使用 RNaseH 处理，然后使用 ELONGASE? Enzyme Mix 将 1/10 的 cDNA 合成反应产物扩增 35 个循环。 RNaseH 产生的障碍 RNaseH 对第一链 cDNA 的影响。RNaseH 在 cDNA 合成期间降解 RNA:DNA 复合体中的 RNA。红色箭头代表潜在的酶切位点。 提高逆转录保温温度 较高的保温温度有助于 RNA 二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数 RNA 模板，在没有缓冲

13、液或盐的条件下，将 RNA 和引物在 65保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用 ThermoScript 逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增（图 6）。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行 cDNA 合成时（见第三章）。如果使用 GSP，确保引物的 Tm 值与预计的保温温度相同。不要在高于 60时使用 oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到 60前在 25保温 10 分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直

14、接将 RNA/引物混合物从 65变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的 2的反应混合物提高特异性（cDNA 热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用 PCR 仪可以简化 RT-PCR所需的多种温度切换。 图 6 温度对不同模板的影响 使用 ThermoScript 或 AMV，以 18S rRNA 基因特异性引物，由 10ng 大豆总 RNA 在所示温度合成cDNA。将 1/10 的 cDNA 反应产物使用高保真 Platinum Taq DNA 聚合酶进行 40 个 PCR 反应循环。 表 2. 逆转录保温温度 Reverse Transcriptase In

15、cubation Temperature AMV 37C-45C M-MLV 37C SuperScriptII RT 37C-50C ThermoScript RT 42C-65C RNA 在高于 65时开始水解，对于1kb 的 RNA 第一链合成温度可以为 70，对于1kb 的 RNA 则需要65。 Tth 热稳定聚合酶在 Mg 存在条件下 作为 DNA 聚合酶，在 Mn 存在条件下作为 RNA 聚合酶。它可以在最高 65条件下保温。然而，PCR 过程中 Mn 的存在会降低忠实性，这使得 Tth 聚合酶不太适合用于高精确度的扩增，如 cDNA 的克隆。另外，Tth 的逆转录效率较低，这会降

16、低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和 PCR，那么没有逆转录的对照反应就不能用来将 cDNA 的扩增产物同污染的基因组DNA 的扩增产物区分开来。 促进逆转录的添加剂 包括甘油和 DMSO 在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开 RNA 二级结构，最多可以加入 20的甘油或 10的 DMSO 而不影响 SuperScript或 MMLV 的活性。AMV 也可以耐受最多 20的甘油而不降低活性。为了在 SuperScript逆转录反应中最大限度提高 RT-PCR 的灵敏度，可以加入 10的甘油并在 45保温。如果 1/10 的逆转录反应产物加入到 PCR 中，那甘

17、油在扩增反应中的浓度为 0.4，这不足以抑制 PCR。 RNaseH 处理 在 PCR 之前使用 RNaseH 处理 cDNA 合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为 cDNA 合成反应中的 RNA 会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH 处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长 cDNA 目标模板时，RNaseH 处理是必需的，比如低拷贝的 tuberous scherosis（图 7）。对这种困难模板，RNaseH 的处理加强了 SuperScript或 AMV 合成的 cDNA 所产生的信号。对于多数 RT-PCR反应，RNaseH 处理是可选的，因为 95保温的 PCR

18、 变性步骤一般会将 RNA：DNA 复合物中的 RNA水解掉。 图 7 RNaseH 处理对 RT-PCR 的影响 使用 SuperScript（S）、M-MLV（M）或 AMV（A ），由 5g Hela RNA 合成人 tuberous sclerosismRNA（5.3kb ）的全长 cDNA，反应产物的一半使用 RnasH 处理 30 分钟，使用 ELONGASE Enzyme Mix 对相当于起始 RNA 0.5的经处理及未处理逆转录产物进行 35 个循环的扩增。 小量 RNA 检测方法的提高 当仅有小量 RNA 时，RT-PCR 尤其具有挑战性。在 RNA 分离过程中加入的作为载体

19、的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入 Trizol 的同时加入无 RNase 的糖元。糖元是水溶性的，可以同 RNA 保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于 50mg 的组织或 106 个培养细胞的样品，无 RNase 糖元的建议浓度为 250g/ml。 在使用 SuperScript的逆转录反应中加入乙酰化 BSA 可以增加灵敏度（图 8），而且对于小量 RNA，减少 SuperScript 的量并加入 40 单位的 RnaseOut 核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在 RNA 分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用 SuperScript进行逆转录反应时加入 BSA 或 RNase

20、 抑制剂。 图 9 一步法 RT-PCR 的灵敏度 使用 SuperScriptOne-Step RT-PCR System 从 0，0.1，1 ，10 ，102，103pg Hela 总 RNA（分别为泳道 1-6）扩增 -actin 片段。反应在 50保温 30 分钟；942 分钟；然后 9415 秒，55 30 秒，68 90 秒进行 40 个循环；随后在 68保温 5 分钟。反应中包含 200 nM 正义和反义引物。 两步法 RT-PCR 比较常见，在使用一个样品检测多个 mRNA 时比较有用。然而一步法 RT-PCR 具有其他优点（表 3）。一步法 RT-PCR 在处理大量样品时易于

21、操作，有助于减少残余污染，因为在 cDNA 合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到 0.1pg 总 RNA，这是因为整个 cDNA 样品都被扩增（图 9）。对于成功的一步法 RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA 合成。 表 3. 一步法和两步法 RT-PCR 的比较 两步法步骤 一步法步骤 起始第一链 cDNA 合成使用： 起始第一链合成使用 Oligo(dT) GSP 引物 随机六聚体 GSP 引物 优点 优点 灵活 方便 引物选择 扩增酶同逆转录酶预先混合 扩增酶的选择 转管步骤少，减少污染可能性 困难 RT-PCR 的优化能力 高灵敏度

22、同 Platinum酶结合提高特异性 适用于大量样品分析 同 Platinum Pfx Taq DNA 聚合酶结合提高忠实性 适用于定量 PCR 适用于在单个样品中检测几个 mRNA 关于扩增酶和产物大小应注意： 对于小于 4kb 的产物使用 Taq DNA 聚合酶或 Platinum Taq DNA 聚合酶 对于小于 12kb 的产物使用 Platinum Pfx Taq DNA 聚合酶或 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity 对于大于 12kb 的产物使用 ELONGAE Enzyme Mix 对于一步法 RT-PCR，如果产物小于 3.5kb

23、，使用 Taq DNA 聚合酶或 Platinum Taq DNA 聚合酶；如果产物小于 9kb，使用 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。 图 9 一步法 RT-PCR 的灵敏度 使用 SuperScriptOne-Step RT-PCR System 从 0，0.1，1 ，10 ，102，103pg Hela 总 RNA（分别为泳道 1-6）扩增 -actin 片段。反应在 50保温 30 分钟；942 分钟；然后 9415 秒，55 30 秒，68 90秒进行 40 个循环；随后在 68保温 5 分钟。反应中包含 200 nM 正义和反义引

24、物。 第三章 增加 RT-PCR 特异性第一链 cDNA 合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成 cDNA 的量和种类。 随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取 5末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA 模板获得 cDNA。为了获得最长的 cDNA，需要按经验确定每个 RNA 样品中引物与 RNA 的比例。随机引物的起始浓度范围为 50 到 250ng 每 20l 反应体系。因为使用随机引物从总 RNA 合成的 cDNA 主要是核糖体 RNA，所以模板一般选

25、用 poly(A)+RNA。 Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞 mRNA 3端所发现的 poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA 大概占总 RNA 的 1%到 2，所以与使用随机引物相比，cDNA 的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对 RNA 和引物的比例及 poly(A)+选择进行优化。建议每 20l反应体系使用 0.5g oligo(dT)。oligo(dT)12-18 适用于多数 RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System 提供了 oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温

26、温度。 基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP 是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA 目的序列杂交，而不象随机引物或 oligo(dT)那样同所有 RNA 退火。用于设计 PCR 引物的规则同样适用于逆转录反应 GSP 的设计（见第五章） 。GSP 可以同与 mRNA3最末端退火的扩增引物序列相同，或 GSP 可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行 RT-PCR，需要设计多于一个反义引物，因为目的 RNA 的二级结构可能会阻止引物结合。建议在 20l 的第一链合成反应体系中使用 1pmol 反义 GSP。 提高逆转录保温温度 为了充分利用

27、GSP 特异性的全部优点，应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性。比如，如果一个 GSP 退火温度为 55，那么如果使用 AMV 或 M-MLV在低严谨性的 37进行逆转录，GSP 所带有的特异性就没有完全利用。然而 SuperScrip和ThermoScript 可以在 50或更高进行反应， （表 2）这就会消除较低温度时产生的非特异性产物（图 10） 。为获得最大的特异性，可以将 RNA/引物混合物直接从 65变性温度转移到逆转录保温温度，并加入预热的 2反应混合液（cDNA 合成热启动） 。这有助于防止低温时分子间碱基配对。使用 PCR 仪可以

28、简化RT-PCR 所需的多种温度转换。 图 10. 逆转录温度对 RT-PCR 特异性的影响 使用 ThermoScript和设计用来同人 DNA 聚合酶 mRNA 退火的 GSP，由 1g Hela RNA 合成cDNA。Thermoscript 加入到预热的反应混合液中，使用 Platinum Taq DNA 聚合酶对 1/10 的 cDNA 进行35 个循环的 PCR。 减少基因组 DNA 污染 RT-PCR 所遇到的一个潜在的困难是 RNA 中沾染的基因组 DNA。使用较好的 RNA 分离方法，如 Trizol Reagent，会减少 RNA 制备物中沾染的基因组 DNA。为了避免产生于基因组 DNA 的产物，可以在逆转录之前使用扩增级的 DNase对 RNA 进行处理以除去沾染的 DNA。将样品在 2.0mM EDTA 中 65保温10 分钟以终止 DNase消化。EDTA 可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖于镁离子的 RNA 水解。为了将扩增的 cDNA 同沾染的基因组 DNA 扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于 cDNA 的 PCR 产物会比来源于沾染的基因组 DNA 的产物短。另外对每个 RNA 模板进行一个无逆转录的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组 DNA 还是 cDNA。在无逆转录时所得到的 PCR 产物来源于基因组。