1、基因表达系列分析 (serial analysis of gene expression，SAGE),生命科学学院 细胞生物学专业,常用的研究基因差异表达的实验方法,在生物体的某个发育阶段，或在某种类型细胞中，有些基因表达，有些基因则不表达，其差异是基因组调控的结果，基因的不同空间间隔表达组合和个体发育控制、形态发生、细胞分化、组织特异性、激素传递或细胞应激反应都直接相关。比较两种不同细胞类型中RNA或cDNA的种类，也就可以发现基因的差别表达。,常用的研究基因差异表达的实验方法有：mRNA差别显示RTPCR法(mRNA diferential displayRTPCR，mRNA DDRTPC
2、R) 消减杂交(subtractive hybridization) 基因表达系列分析(serial analysis of gene expression，SAGE) 等。,传统研究基因表达差异方法的不足,表达序列标签(EST)测序、mRNA差异显示、消减杂交及差异杂交等在克隆差异表达基因方面做出了巨大贡献，但由于它们的随机性均无法描绘出基因表达模式的全貌。所获得的多限于高丰度或表达差异大的基因,SAGE技术的建立,SAGE是1995年由Veleulesce等建立的一种新的基因表达模式研究技术，它可以在整体水平上对细胞或组织中的大量转录本同时进行定量分析，而无论其是否为已知基因。,SAGE技
3、术概念及原理,第一，910 bp短标签(tag)是从一个转录本内分离得到，充分含有识别转录本的信息，因为10 bp(410)从理论上说已足够代表任何一个物种的转录产物，但其前提是假设生物体内的碱基序列是随机分布的；第二，连接多个短标签，就能把多个tag集中到一个克隆中进行测序,SAGE技术是一种快速而高效地分析组织或细胞基因表达的方法，它不仅能够全面地分析特定组织或细胞表达的基因并得到这些基因表达丰度的数量信息，而且还可以比较不同组织、不同时空条件下基因的表达差异。,常规 SAGE方法的操作步骤及原理,1、生物体特定阶段组织或细胞中全部mRNA的制备。2、cDNA的双链的合成 以biotiny
4、lated oligo(dT）为引物将mRNA反转录合成cDNA 。3、锚定酶酶切 锚定酶具有4bp的识别位点，常用的锚定酶如：Nla，其酶切位点为CATG 4个碱基序列。酶切后产物通过生物素磁珠（链霉素抗生物素蛋白珠）分离含polyA尾的cDNA片段，将此产物平均分为2份。4、cDNA片段与接头（Linker）的连接 接头包括4条链：Linker 1A、Linker 1B、Linker 2A、Linker 2B。将Linker 2A以及Linker 2B末端去磷酸化，并与相应的Linker 1A以及Linker 1B进行退火形成接头Linker 1和Linker 2.（接头末端含有锚定酶以及
5、标签酶酶切位点）。5、标签酶酶切释放标签序列 标签酶是一种类限制酶，它能在距识别位点约20碱基的位置切割DNA双链。6、连接形成双标签（Ditages） 将含有Linker 1和Linker 2的标签在连接酶的作用下连接形成Linker1、2的双标签。,常规 SAGE方法的操作步骤及原理,7、PCR扩增（Ditages） PCR扩增依据Linker 1和Linker 2序列设计。只有含有Linker 1和Linker 2的双标签才能得到有效的扩增。采用12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化PCR产物，回收102bp的扩增片段。8、分离纯化双标签 采用锚定酶酶切回收的扩增产物，酶切产物采用12%的聚丙烯
6、酰胺凝胶电泳回收6bp的片段，即得双标签。9、双标签随机连接形成串联子（Concatemers） 纯化的双标签采用连接酶使之成锁链状形成不同大小的串联子。8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳回收一定片段长度的串联子。10、克隆串联子、测序 将串联子克隆至含Sph 酶切位点的pZero载体中，测定串联子的序列。11、计算机辅助分析 测序结果采用SAGE软件包进行分析，获得标签序列及其丰度信息，每个标签可通过与Genbank数据库或者EST数据库数据进行对比，从而可确认其代表的基因。,SAGE技术特点,灵敏性 SAGE是一项研究生物基因表达快捷、有效的技术，相对于那些经典的实验技术，如EST测序法等检测不到的
7、低丰度的基因，具有相当高的灵敏性。Miao Sun等的研究发现，在相同情况下，在转录物的检测上SAGE比EST技术的敏感度要高26倍。,全局性 其它的方法如array、PCR等，都是对已知基因设计探针来检测生物个体在不同的生理或病理状态下的基因表达水平，但是对于那些大量新基因却无法推测其变化水平，即这些都是一种封闭式的差异基因表达技术。相反，作为开放式的SAGE则不需事先知道基因的信息，就能够全局性地检测所有基因的表达。因此，SAGE具有传统方法所不具有的优势，另外一个显著的特点是同时分析大量基因的转录信息提供表达谱。,SAGE 应用前景,应用SAGE进行转录组分析,转录组(transcrip
8、tome)是指一定类型细胞内所有转录的基因及其丰度，它决定着细胞的表型，与基因组不同，转录组是不稳定的，不同种类的细胞具有不同的转录组。1997年，Velculescu等应用SAGE成功地分析了酵母的转录组，这也是迄今为止第1个详尽的真核生物转录组。,SAGE技术能应用于寻找新基因,SAGE技术在单一反应中同等的分析来源于不同的基因的短标签，克服了转录本丰度的影响，在新基因的分析中占有独特的地位 。SAGE的标签包括9个碱基，加上锚定酶的位点序列(4个碱基)，共可确认13碱基序列。如果一个标签检索已知序列时没有同源序列，13碱基片断就可作为探针筛选cDNA文库得到cDNA克隆,高通量检测技术成
9、为基因表达研究的有力工具,高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是在大量核酸、多肽信息累计（即资料库）基础上，采用微板作为分子载体，制作集成“芯片”，以自动化操作系统进行分子杂交的试验过程。因为快捷、灵敏、信息量大，适合大规模操作，故称“高通量”。高通量检测技术适合“组学”（omics）研究，更适合生命活动过程相关的基因表达谱分析。,1）目前，高通量测序技术不仅仅在DNA测序中起到重要的作用，并且已经应用于基因组分析的各个方面：在DNA水平上，可以大规模地分析基因组甲基化、筛选突变基因、检测基因多态性；在RNA水平上，可以对RNA片段进行扫描、定量与鉴定，对全基因组进行广谱表达研究。,2）高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易地解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列, 高度同源), 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度,同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA。,高通量测序技术是新一代基因表达谱分析方法,高通量测序技术可以一次对几十万到几百万个DNA分子片段进行序列测定，从而快速获得转录组或基因组的全貌, 又被称为深度测序(deep sequencing)。,Thank you,
