1、1,第十四章 基 因 诊 断 和 基 因 治 疗 Gene diagnosis and Gene Therapy 第一节 基因诊断 第二节 基因治疗,2,第一节 基因诊断重组DNA技术极大地丰富了我们对人类遗传病分子病理学的知识，同时也提供了从DNA水平对遗传病进行基因诊断的手段。基因诊断：就是利用DNA重组技术从DNA 水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷，又称DNA分析法。,3,一、直接诊断,直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或邻近的DNA序列作为探针，或通过PCR 扩增产物，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。它主要适用于已知基因异常疾病的诊断。,4,1、Gene 缺失遗传病
2、的诊断,1）地贫的Gene诊断 基因不同程度的缺失引起不同类型的地贫，基因缺失14个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个 Gene时可得到10kb片段。,BamHI,BamHI,2,1,2,10 kb,14 kb,probe,5,以Gene为探针，Southern blot 方法检测,/ /- /- - - /- - - - / - -正常 缺1 缺2 缺3 缺4,14kb,10kb,6,2）DMD/BMD的缺失诊断（进行性肌营养不良或假肥大型）,DMD是一种严重致死性疾病（XR），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。BMD临床症状与DMD相似，但症状较轻。 Gen
3、e 定位Xp21 ， Gene 2300kb,79 个Exon ，cDNA全长13974bp 编码3685 Aa，分子量427kD。 DMD/BMD 70%左右为缺失型，基因很大，缺失可能发生在不同的部位。应用多重PCR扩增检测，判断缺失状态。,7,多重PCR扩增后电泳检测结果,病例,外显子,1 2 3 4 5 6 7 8,Pm 3 43 50 13 6 47 60 52,bp,535,113,8,2、突变型遗传病的基因诊断,例 如： 镰形细胞贫血的Gene诊断 已知突变基因编码珠蛋白链的第6位密码子GAGGTG谷Aa缬Aa,9,1）RFLP诊断,已知限制酶MstII识别序列 MstII 1.
4、15kbCCTG AGG 1.35kb xprobeCCTGTGG 突变后不能识别， 酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。,10,限制酶切片段电泳后，经Southern Blot检测，结果：,1.35kb1.15kb/ /S S/S 正常 镰状 镰状贫血,11,2）ASO探针诊断,已知突变Gene部位和性质，合成寡和苷酸探针，32P标记，进行Southern Blot 杂交/斑点杂交。Normal Gene Probe与正常 杂交Mutation S Gene Probe与异常 S杂交,12,斑点杂交结果：,/ /S S/S正常探针突变探针,13,二、间接诊断,主要通过Gene和DNA多态
5、的连锁分析作出诊断。当致病基因虽然已知，但其异常尚属未知时，或疾病Gene本身尚属未知时，可通过对受检者及其家系进行连锁分析，推断受检者是否获得了带有致病基因的染色体或DNA 片段。连锁分析是基于遗传标记与Gene连锁，子代是否获得遗传标记间接地判断做出诊断。这些遗传标记是基因组中的DAN 多态，如：RFLP，VNTR 等。,14,1、Gene异常不明确的遗传病的诊断,例：成年型多囊肾病APKD，AD ，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。 APKDGene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实
6、APKD Gene与珠蛋白基因3端附近的一段小卫星DNA序列（3HVR）紧密连锁，因此，可以通过RFLP连锁分析进行诊断。,15,以3HVR为probe与PvuII酶切后的家系有关成员的Gene组DNA杂交Southern Blot杂交Gene组DNA probe （3HVR） PvuII酶切 DNA片段杂交 结果,16,结 果,1 21 2 3 4 557kb34kb23kb,17,结果分析,患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,说明致病基因与3.4kb片段连锁,并按孟德尔方式遗传.II5不含3.4kb片段,产前诊断正常.,18,PCRRFLP诊断,甲型血友病的基因诊断，已知甲型血友
7、病XR，获得家系成员基因组DNA 。PCR 142 bpBcLI 142bp 99 bp 43bp电泳结果分析 ？,p1,p2,142bp,99bp,43bp,Bcl I,Bcl I -,Bcl I +,19,问:1/ 2、1诊断；2/ 1是男或是女发病？,142bp,99bp,1 2,1,2,3,III,1,20,结果分析,1）先症者II2具有99bp片段而发病，该片段来自母亲。 2）II2有142bp/99bp杂合子。142bp来自父亲，为正常片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。 3）1为99bp片段如果是 男性 为患者（99bp片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方）,21,基因诊断意义,现证病人的诊断：争取有效、针对性治疗。 产前诊断：意义更为重要，预防遗传病患儿的出生,END,
