1、主要内容,1微生物的遗传 2微生物的变异 3微生物基因重组 4菌种的衰退、复壮和保藏,第4章 微生物的遗传与变异,引言（相关概念）,遗传(heredity 或 inheritance) 指生物的上一代将自己的一整套遗传因子传递给下一代的行为或功能，具有极其稳定的特性。 遗传型(genotype)：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子，即基因的总和。 遗传型是一种内在的可能性或潜力，其实质是遗传物质上所负载的特定遗传信息。 表型(phenotype) 具有一定遗传型的个体，在特定的外界环境中，通过生长和发育所表现出来的种种形态和生理特征的总和，即为其表型； 即是遗传型在合适的环境下的具
2、体表现。 遗传型+环境条件 表型,变异(variation) ：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。 变异的特点是在群体中以极低的几率出现，性状改变的幅度极大， 变化后的性状是稳定的、可遗传的。,饰变(modification),指不涉及遗传物质的改变，而只发生在转录、转译水平上的表型变化，即同样遗传型的生物，在不同的外界条件下，会呈现不同的表型，这种表型上的差别，只能称为适应或饰变。 其特点是整个群体中的几乎每一个体都发生同样的变化，性状变化的幅度较小，遗传物质不变。不是真正的变异，是不遗传的。 引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。,例如：粘质
3、沙雷氏菌：在25下培养，产生深红色的灵杆菌素；在37下培养，不产生色素；如果重新将温度降到25，又恢复产色素的能力。,微生物是遗传学研究中的明星,微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。 很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。 对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。,第一节 微生物的遗传 一、遗传变异的物质基础,1883-1889年间，Weissmann提出种质连续理论，认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物； 20世纪初，发现了染色体并提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上； 1944年后，由于连续利用微生物这一有利的实验对象进行了三
4、个著名的实验，才以确凿的事实证实核酸，尤其是DNA才是遗传变异的真正物质基础。 经典转化实验、噬菌体感染实验、植物病毒重组实验,三个经典实验与遗传物质,1、转化试验：肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae),以肺炎链球菌作为研究对象，肺炎链球菌可以使人患肺炎，也可以使小白鼠患败血病而死亡； 有荚膜者是致病性的，它的菌落表面光滑(smooth)，称为S型； 有的不形成荚膜，无致病性，菌落外观粗糙(rough)，故称R型。,Griffith经典转化实验(1928),RII型活菌,SIII型活菌,SIII型热死菌,RII型活菌,SIII型活菌,混合培养,健康,健康,健康,健康,
5、健康,健康,健康,病死,病死,病死,Griffith（格里菲斯）转化试验结果,(有毒)死细菌中的某种物质转移到(无毒)活细菌中，并使之具有毒性，导致小家鼠死亡； 他将这种细菌遗传类型的转变称为转化，并将引起转化的物质称为转化因子(tranforming principle)； 当时的化学与生化分析技术还无法鉴定杀死细菌中的成分，因而不知转化因子为何物。,离体转化实验,1944年，O.T.Avery、C.M.Macleod和M.McCarty从热死的S型肺炎链球菌中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化实验。,Avery等的体外培养实验(1944),分离后的S型细胞物质对R型
6、细胞的转化,离体转化实验结果,来源于加热杀死的SIII细菌，并使 RII细菌转化成为SIII型细菌的转化因子是DNA。 Avery等人的实验实际上表明：决定细菌遗传类型的物质是DNA，即证明了DNA就是遗传物质。,2、噬菌体感染实验,1952年，A.D.Hershey和M.Chase发表了证明噬菌体的遗传物质基础的著名实验噬菌体感染实验。 首先，他们将E.coli培养在以放射性32P3O4或35S2O4作为磷源或硫源的合成培养基中。结果,可以获得含32P-DNA(噬菌体核心)的噬菌体或含35S-蛋白质(噬菌体外壳)的两种实验用噬菌体。,蛋白质外壳,在噬菌体的感染过程中，其蛋白质外壳未进入宿主细
7、胞。,DNA核心,进入宿主细胞的DNA经增殖、装配后,能产生一大群既有DNA核心又有蛋白质外壳的完整噬菌体颗粒。,证明：在其DNA中，含有包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。 通过电子显微镜的观察也证实了这个论点。 从而证明了遗传物质基础是DNA。,3、植物病毒的重组实验,H.Fraenkel-Conrat(1956)用含RNA的烟草花叶病毒(TMV)进行了著名的植物病毒重建实验。 把TMV和 HRV （霍氏车前花叶病毒）的蛋白质外壳与RNA相分离。 用TMV的RNA与HRV的蛋白质外壳， HRV的RNA与TMV的蛋白质外壳重建后的杂合病毒去感染烟草。,植物病毒的重组,核酸(这里为RNA)是
8、病毒的遗传物质。 至此,我们可确信无疑地得出结论,只有核酸才是贮存遗传信息的真正物质。,实验结果,三个经典试验结果,细胞生物的遗传物质是双链DNA； 病毒的遗传物质可以是单链的或双链的DNA或RNA， 即：ssDNA，dsDNA，ssRNA或dsRNA。,朊病毒的发现和思考无论是DNA还是RNA作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。但朊病毒的发现对“蛋白质不是遗传物质”的定论也带来一些疑云。PrP是具有传染性的蛋白质致病因子，迄今未发现蛋白内有核酸，但已知的传染性疾病的传播必须有核酸组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。那么这是生命界的又一特例呢？还是因为目前人们的认识和技术所限而
9、尚未揭示的生命之谜呢？还有待于生命科学家去认识和探索。,（一）遗传物质DNA的分子结构及其多样性,1 DNA复制,4dNTP,2转录,3 转译(翻译）,原核生物只有一种RNA多聚酶； 转录后不需加工，直接作为mRNA； mRNA只能存活几分钟、几小时； 转录和转译可同时进行，是偶联的；,微生物基因表达的调控,调节基因也有转录和转译作用，以其模板生成的蛋白质称为阻遏蛋白或变构蛋白。阻遏蛋白的作用是能与操纵基因结合，阻止了RNA聚合酶向结构基因滑动，即使结构基因失去了合成mRNA的能力。先有调节基因决定的阻遏蛋白，与操纵基因结合从而阻止了基因的表达。,基因控制系统,操纵子,调节基因,启动基因 操纵
10、基因 结构基因,阻遏蛋白也能与培养基中的底物(由结构基因转录、转译的酶催化分解的底物)相结合，当阻遏蛋白与底物结合后，阻遏蛋白从操纵基因分离，从而开放了RNA聚合酶通向结构基因的通道，便能转录成mRNA，并转译成蛋白质(酶)。,2.1遗传物质在细胞内的存在部位和方式七个水平,细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核 细胞核水平：原与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA； 染色体水平：倍性(真核)和染色体数； 核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链； 基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录翻译； 密码子水平：信息单位，起始和终止
11、； 核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基。,（二）遗传物质在微生物中的存在,2.2微生物遗传物质的存在形式,存在的主要形式染色体 染色体外的遗传物质 真核微生物中的细胞器DNA：叶绿体、线粒体、中心粒、毛基体等 原核微生物和真核微生物的酵母菌：质粒 插入序列、转座子、Mu病毒等 RNA作为遗传物质 朊病毒的遗传物质,染色体指携带细胞功能所必备的基因的遗传单元。 病毒是非细胞生物，它们的全套遗传基因称为基因组，但不足以形成染色体。 原核生物的染色体常为一个环状的DNA分子。 真核生物的细胞有几条至几十条染色体，各含一个线状的DNA分子。,真核生物的染色体结构,细菌染色体DNA的大小和结构,原核生
12、物的质粒,游离于原核生物染色体外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子，即cccDNA (circular covalently closed DNA)，称为质粒。 质粒具有超螺旋状的结构，携带着某些染色体所没有的基因，赋予原核生物某些对其生存必不可少的特殊功能。,质粒的特征,自我复制能力，为复制子，单拷贝或多拷贝 编码产物赋予细菌某些性状特征 可自行丢失与消除（含质粒的细胞在正常培养基上遇化学、物理因素处理时，质粒的复制受到抑制而核染色体的复制继续进行，子代细胞中质粒消除） 有转移性（可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个细菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；
13、质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体） 可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在） 对于细菌的生存并不是必要的 功能多样化 功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。,质粒的主要类型,致育因子 Fertility factor，F因子（制育因子，性因子，约2%核染色体，94.5kb，编码的基因约1/3与接合有关） 抗性因子 Resistance factor，R因子（抗药性因子，其基因编码的物质对抗生素有抗性）,Ti因子
14、诱癌质粒，可同植物细胞中的核染色体整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使其变成癌细胞。,Col因子大肠杆菌素因子，即使大肠杆菌分泌大肠杆菌素,巨大质粒 分子量200300106Da，比一般质粒大几十到几百倍，上面有固氮基因。,降解性质粒可以编码许多降解性酶类，使细菌降解特殊物质。,只在假单胞菌属中发现。 它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。,产细菌素的质粒 Bacteriocin production plasmid 毒性质粒 Virulence plasmid 代谢质粒 Metabolic plasmid (降解质粒) 隐秘质粒
15、Cryptic plasmid,第二节 微生物的变异 2.1基因突变和突变率,基因突变(gene mutatiaon)简称突变，是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构突然发生的可遗传的变化，突变几率一般在10-610-9范围内。 突变率(mutation rate)：每一细胞在每一世代发生某一性状的突变几率，称为突变率，它可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株的数目来表示。,变异,基因突变,基因重组,诱变,自发突变,点突变染色体畸变,碱基置换 移码突变,转换 颠换,缺失 添加,缺失 添加 易位 倒位,2.2 突变类型,凡能用选择性培养基快速选择出来的突变型，称为选择性突变株(select
16、ive mutant)， 如营养缺陷型、抗性突变型和条件致死型等； 反之则称为非选择性突变株(non-selective mutant)， 如形态突变型、抗原突变型和产量突变型等。,选择性突变,非选择性突变,(死活突变),营养缺陷型 抗性突变型 条件致死突变型,形态突变型 抗原突变型 产量突变型,(非死活突变),2.3 突变的特点,不对应性：突变性状与原因之间无直接对应关系。 自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。 稀有性：突变率低且稳定。 独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。 可诱发性：诱变剂可提高突变率。 稳定性：变异性状稳定可遗传。 可逆性：从原始的野生型基因到变异株的
17、突变称为正向突变(forward mutation)，从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变(back mutation或reverse mutation)。,两种看法,一种观点认为，是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境(指其中所含的抵抗对象)诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。 另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。,基因突变的自发性和不对应性,1943年，S.E.Luria和M.Delbruck根据统计
18、学的原理，设计了变量试验(fluctuation test)，又称波动试验或彷徨试验； 1949年，Newcombe设计了涂布试验(Newcombe experiment)； 1952年，J.Lederberg夫妇发表了著名的平板影印培养法和细菌突变株的间接选择论文，它更好的证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发产生的。,Luria等的变量试验,敏感于噬菌体T1,T1,实验要点是：取敏感于噬菌体T1的大肠杆菌对数期肉汤培养物，用新鲜培养液稀释成浓度为103个m1的细菌悬液，然后在甲、乙两试管内各装10m1。接着把甲管中的菌液先分装在50支小试管中(每管装0.2m1)，保温2436小时后，即把
19、各支小管的菌液分别倒在50个预先涂有T1的平板上，经培养后分别计算各皿上所产生的抗噬菌体的菌落数；乙管中的10ml菌液不经分装先整管保温2436小时，然后才分成50份加到同样涂有Tl的平板上，经适当培养后，同样分别计算各皿上产生的抗性菌落数。结果发现，来自甲管的50皿中，各皿间抗性菌落数相差极大，而来自乙管的则各皿数目基本相同。这就说明大肠杆菌抗噬菌体性状的突变，不是由所抗的环境因素噬菌体诱导出来的，而是在它接触到噬菌体前，在某一次细胞分裂过程中随机地自发产生的。这一自发突变发生得越早，则抗性菌落出现得越多，反之则越少。噬菌体这里仅起着淘汰原始的未突变的敏感菌的作用。利用这一方法，还可计算出突
20、变率。,涂布试验,平板影印培养法,3 基因突变机制,3.1 自发突变机制,(1)背景辐射、环境因素,(2)微生物自身有害物质,(3)互变异构效应,(4)环出效应,3.2 诱发突变机制,基因突变,一对碱基被另外的一对碱基置换。 转换(transition)：即DNA链中的一个嘌呤被嘌呤或嘧啶被嘧啶所置换。 颠换(transversion)：即一个嘌呤被嘧啶或嘧啶被嘌呤所置换。,碱基的置换,碱基转换的分子机制以亚硝酸为例HNO2 胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U）HNO2 腺嘌呤（A） 次黄嘌呤（H）HNO2 鸟嘌呤（G） 黄嘌呤（X） 这些反应及形成物均可在DNA复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换。
21、,腺嘌呤（A）变成次黄嘌呤（H）后引起的转换过程：,腺嘌呤氧化脱氨后形成烯醇式次黄嘌呤（He） He通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（HK） DNA复制时，HK 与胞嘧啶（C）配对 DNA第二次复制时，C与G正常配对，实现了转换。,亚硝酸引起的AT-GC转换细节,移码突变,诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增加或缺失，从而使后面的全部遗传密码发生转录和转译错误。,由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frame-shift mutant）。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是DNA分子的微小损伤。 丫啶类染料，包括原黄素、丫啶黄、丫啶橙和-氨基丫啶等，以及一系列称为ICR类的化合
22、物，都是移码突变的有效诱变剂。,丫啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示：,染色体畸变（chromosomal aberration）,某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤（macrolesion）染色体畸变，它包括： 染色体结构上的变化： 缺失（deletion） 重复（duplication） 易位（translocation） 倒位（inversion） 染色体数目的变化,分为染色体内畸变和染色体间畸变两类。 染色体内畸变：只涉及一条染色体上的变化， 如发生染色体的部分缺失或重复时，其结果可造成基因的减少或增加； 如发生倒位或易位
23、时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。 倒位-是指断裂下来的一段染色体旋转180后，重新插入到原来染色体的原位置上，从而使其基因顺序与其它的基因顺序相反； 易位-是指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。 染色体间畸变：指非同源染色体间的易位。,转座因子(transposible element),跳跃基因(jumping gene)在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序。,染色体畸变的几种形式,插入序列(insertion sequence)：分子量小，0.71.4kb，只能引起转座效应而不含其它任何基因。,转座子(Tn, transp
24、oson)：分子量为225kb，含有几个到十几个基因。能插到受体DNA分子的许多位点上。,Mu噬菌体(mutator phage)：是E. Coli的一种温和噬菌体，分子量大，约37kb，含20多个基因，可以引起插入突变。,诱变剂的共性原则,很多种化学物质，能以各种机制导致DNA的突变； 化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比； 超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用； 90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。,诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变剂。 种类：诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式。,若干诱变剂的作用机制
25、及诱变功能 有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个丫啶分子时，就变成0.68nm），从而在DNA复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变。,诱变因素 在DNA上的初级效应 遗传效应 碱基类似物 掺入作用 AT=GC双向转换羟 胺 与胞嘧啶起反应 GCAT的转换亚硝酸 A、G、C的氧化脱氨作用 AT=GC双向转换交 联 缺失 烷化剂 烷化碱基（主要是G） AT=GC双向转换烷化磷酸基团 ATTA的颠换丧失烷化的嘌呤 GCCG的颠换糖-磷酸骨架的断裂
26、 巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）丫啶类 碱基之间的相互作用（双链变形） 码组移动（或）紫外线 形成嘧啶的水合物 GCAT转换形成嘧啶的二聚体 码组移动（或） 交 联 电离辐射 碱基的羟基化核降解 AT=GC双向转换DNA降解 码组移动（或） 糖-磷酸骨架的断裂 巨大损伤 （缺失、重复、倒位、易位）丧失嘌呤 加热 C脱氨基 CGTA转换Mu噬菌体 结合到一个基因中间 码组移动,Ames试验,美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明； 检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率； 回复突变(reverse m
27、utation或back mutation)：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。,Ames试验操作,艾姆氏试验的基本方法,缺陷型菌株,营养缺乏型平板,37 23天,. . . . . . .,. :. .: : . ; . ;. . .:,. :. .: : . ; . ;. . .:,. . . . . . .,待测试剂,正常回复突变,诱变剂诱变,艾姆氏试验已成为测试化学物质诱变作用的标准方法， 其原理是检验待测试剂能否使营养缺陷型菌株的回复突变增加。,应用实例,国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十
28、分流行； 但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用；,Ames试验补充,由于生物体内、体外可能存在的差异，可在体外加入哺乳动物(如大鼠)微粒体酶系统，使待测物活化，使Ames试验的准确率达80-90%。,4 DNA损伤的修复,4.1紫外线对DNA的损伤及修复,在光照下光解酶转变紫外线诱导的胸腺嘧啶二聚体返回单聚体。,光照,4.2切补修复暗修复 为把它与光复活作用区分开，切补修复常称为暗修复。它作为许多不同类型的DNA损伤修复的普遍系统，如嘧啶二聚体和错误碱基配对引起的DNA
29、损伤。B、C和基因产物结合形成一个核酸内切酶，它能识别碱基改变所引起的DNA螺旋扭曲。uvrABC内切核酸酶在损伤的任何一边作一切口，聚合酶I切除和替换损伤部位的碱基，DNA连接酶将缺口填补上。,1、由核酸内切酶切开二聚体的5末端，形成3-OH和5-P的单链缺口 2、核酸外切酶从5-P到3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口。 3、DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起合成缺失片段。 4、连接酶将新合成的3-OH与原有的5-P相连接。,4.3 重组修复(复制后修复) 胸腺嘧啶二聚体不能被复制，不是在此位点阻塞，而是DNA聚合酶能跳过该损伤部位，沿着下面DNA的模板，恢复DN
30、A继续合成。在新合成的DNA子链上二聚体对面留下一个缺口。由于需要一个完整的链作为模板，不能用切补修复来恢复。而这个缺口能由RecA蛋白调控的通过与母链DNA螺旋发生重组来填补。母链DNA在二聚体的对面应当含有完整的序列。尽管重组并不能修复损伤，它确创造了两个新的DNA分子，通过切补修复完成了修复的功能。,细胞在不切除二聚体的情况下，以带有二聚体的这条链为模板合成互补单链，但在每个二聚体附近留有一空隙。通过染色体交换，空隙部位就不在面对着胸腺嘧啶二聚体，而是面对着正常的单链，在这种条件下，DNA聚合酶和连接酶起作用将空隙部位进行修复， 重组修复中的DNA损伤并没有去除，但随着微生物的传代繁殖，
31、损伤的比例逐渐降低。,4.4 SOS修复系统 细胞中有许多基因和操纵子受RecA蛋白协同调控和LexA蛋白阻遏转录。它涉及处理DNA损伤和称为SOS修复系统。为一个倾向差错的修复系统，该系统与DNA聚合酶相互作用，使之通过嘧啶二聚体继续复制DNA。35校正读码能力的酶被抑制，结果碱基能随机插入二聚体的对面，没有精确的碱基对(参见C2)，这个机制是紫外线所以致突变的主要原因，因为大多数的其他系统是精确修复DNA的。 SOS修复系统是由RecA蛋白诱导的，由于存在DNA损伤，RecA蛋白构型改变显示出激活态。激活态的热RecA蛋白引起LexA蛋白被蛋白水解酶切开，结果LexA蛋白不再作为一个转录的
32、阻遏物。只要细胞中存在DNA的损伤，SOS修复系统的基因就能表达。一旦DNA损伤被消除，RecA蛋白不再有活性，不再作为LexA蛋白水解诱导物，IexA蛋白在细胞中累积，并且抑制SOS修复的基因转录。,第三节 微生物基因重组 3.1原核微生物的基因重组,主要有： 转化(transformation)是指细胞从周围介质中摄取来自不同基因型细胞的DNA，使受体的基因型或表型发生相应变化的过程。 转导(transduction)是由噬菌体介导的将DNA片段从供体菌转移到受体菌的过程。 接合(conjugation)在供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞向受体细胞转移的过程。 原生质融合等几种
33、方式,3.1.1转化(transformation),转化现象是在1928年由Griffith进行肺炎双球菌的研究中发现的。 受体菌直接接受供体菌的DNA片段而获得部分新的遗传性状的现象，就称为转化或转化作用。,枯草芽孢杆菌的自然转化模型：,a）细菌生长在一定的培养条件下生长到一定阶段，以枯草芽孢杆菌为例是在葡萄糖基本培养基中培养到对数生长末期到稳定期，细胞向胞外分泌一种小分子的蛋白质，称为感受态因子，其分子量为5000到10000道尔顿。 b）当培养液中的感受态因子积累到一定浓度后，与细胞表面受体相互作用，通过一系列信号传递系统诱导一些感受态一特异蛋白质(competence specifi
34、c protein)表达，其中一种是自溶素(autolysin)，它的表达使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与DNA结合的活性。 c）DNA以双链形式在细胞表面的几个位点上结合并遭到核酸酶的切割，核酸内切酶首先切断DNA双链中的一条链，被切断的链遭到核酸酶降解，成为寡核苷酸释放到培养基中，另一条链与感受态一特异蛋白质结合，并被引导进入细胞， d）进入细胞的外源DNA通过同源重组以置换的方式整合进受体染色体DNA，经复制和细胞分裂后形成重组体。,3.1.2转染(transfection),如果把噬菌体或其他病毒的DNA(或RNA)抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生
35、正常的噬菌体或病毒后代，这种现象称为转染(transfection)。 它与转化不同之处是病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌，中间也不发生任何遗传因子的交换或整合，最后也不产生具有杂种性质的转化子。,3.1.3转导(transduction),转导现象是由J.Lederberg等1952年研究鼠伤寒沙门氏菌时发现的。 通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。,转导类型,依据转导噬菌体的来源和性质不同，可以区分为两种类型的转导作用。 普遍转导由于完全缺陷型噬菌体携带了供体菌染色体片段，当它去感染受
36、体菌时，使后者获得这部分遗传性状的现象称为普遍性转导 完全普遍转导(稳定的转导子)， 简称完全转导； 流产转导(不稳定的转导子)；特点：供体的任何基因都有可能进入受体细胞局限转导是指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象 低频转导 高频转导特点： 只传递供体菌的少数特定基因,3.1.4溶源转变,溶源转变(lysogenic conversion)：是一种与转导相似，但本质上却不相同的特殊现象，即当温和噬菌体感染其宿主后，发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。 当宿主丧失这一噬菌体时，通过
37、溶源转变而获得的性状也同时消失。 溶源转变与转导有本质上的不同，首先是它的温和噬菌体不携带任何供体菌的基因；其次，这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的。,3.1.5接合(conjugation),供体菌(“雄”)通过其性菌毛与受体菌(“雌”)相接触，前者通过传递不同长度的单链DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。,3.1.6原生质体融合(protoplast fusion),通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传稳定的融合子(fusant)的过程，称
38、为原生质体融合。,3.2真核微生物的基因重组,在真核微生物中，基因重组主要有： 有性杂交 准性杂交 原生质体融合 转化等形式,3.2.1有性杂交,一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术；,3.2.2准性杂交(parasexual hybridization),准性生殖是一种类似有性生殖，但比有性生殖更为原始的一种生殖方式，它可以使同种生物的两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。 准性生殖常见于某些真菌，尤其是半知菌。,3.3 微生物遗传变异知识的应用,诱变育种 原生质体融合育种 基因工程 微生物菌种的衰退、复
39、壮和保藏,3.3.1诱变育种,一般方法 1出发菌株的诱变处理：出发菌株的选择，诱变剂的选择，选择最适诱变剂量 2突变体的筛选：初筛、复筛。,诱变育种的基本规律,诱变育种的基本过程,选择选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大试验,出发菌株的选择,出发菌株用来育种处理的起始菌株。 出发菌株应具备： 对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力； 出发菌株的来源： 自然界直接分离到的野生型菌株； 历经生产考验的菌株； 已经历多次育种处理的菌株。,3.3.2原生质体融合育种,融合的步骤：选择亲本、原生质体制备、原生质体融合、原生质体再生、融合子的检出与鉴定。,3.3.
40、3 基因工程(gene engineering),基因工程是指在基因水平上的遗传过程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体(vactor)的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体菌中，让外源遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种育种技术。,基因工程的基本操作,目的基因的取得： 从适当的供体细胞的DNA中直接分离； 通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA； 由化学方法合成特定功能的基因； 载体的选择： 目的基因与载体DNA的体外重组： 重组载体引入受体细胞。,4菌种的衰
41、退、复壮和保藏 4.1菌种的衰退(degeneration),菌种的衰退和复壮遗传性的变异是绝对的，稳定是相对的，退化的变异是大量的，而进化性的变异却是个别的， 如果不进行自觉的、认真的人工选择，大量的自发突变株就会导致菌种的衰退。 衰退：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象。,常见的衰退现象,菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等； 代谢产物生产能力下降； 其对宿主寄生能力下降等。,衰退的防止,控制传代次数； 创造良好的培养条件； 利用不同类型的细胞进行接种传代； 采用有效的菌种保藏方法
42、。,4.2 复壮(rejuvenation),狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找到少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施； 广义的复壮则是一项积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前，就经常有意识的进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高，实际上是一种利用自发突变(正变)不断从生产种进行选种的工作。,菌种的复壮,纯种分离；大体上可以分为两类，一类较粗放，一般只能达到“菌落纯”的水平，即从种的水平来说是纯的； 另一类是较精细的单细胞或单孢子分离方法，可以达到细胞纯即“菌株纯”
43、的水平。 通过宿主体内生长进行复壮； 淘汰已衰退的个体。,4.3 菌种的保藏(preservation) 4.3.1 世界部分菌种的保藏中心,美国典型菌种保藏中心(ATCC，American Type Culture Collection)， 美国的“北部地区研究实验室”(NRRL)， 荷兰的霉菌中心保藏所(CBS)， 英国的国家典型菌种保藏所(NCTC)， 前苏联的全苏微生物保藏所(UCM) 以及日本的大阪发酵研究所(IFO)等都是有关国家有代表性的菌种保藏机构。,4.3.2我国菌种的保藏中心,普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC):中科院微生物所,北京(AS),真菌、细菌;中科院武汉病毒
44、研究所,武汉(AS-IV),病毒。 农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)：中国农业科学院土壤肥料研究所,北京(ISF)。 工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，轻工业部食品发酵工业科学研究所, 南京(ID),真菌;卫生部药品生物制品检定所,北京(NICPBP),细菌；中国医学科学院病毒研究所,北京(IV),病毒。,我国菌种的保藏中心,抗菌素菌种保藏管理中心(CACC):中国医学科学院抗菌素研究所北京(IA);四川抗菌素工业研究所,成都(SIA),新抗菌素菌种;华北制药厂抗菌素研究所,石家庄(IANP),生产用抗菌素菌种。 兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)农业部兽医药品监察所,北京(C
45、IVBP) 。,4.3.3 菌种保藏目的,存活，不丢失，不污染； 防止优良性状丧失； 随时为生产、科研提供优良菌种。,4.3.4菌种保藏的原理,首先挑选典型菌种(type culture)的优良纯种，最好采用它们的休眠体(如分生孢子、芽孢等)； 其次，还要创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等。,菌种保藏的原理,水分对生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥尤其是深度干燥，在保藏中占有首要地位； 五氧化二磷、无水氯化钙和硅胶都是良好的干燥剂，高度真空可以同时达到无氧和深度干燥的双重目的。 低温是保藏中的另一重要条件。,4.3.5菌种保藏方法,一种良好的保藏方法，首先应能保持原菌的优良性状不变，同时还须考虑方法的同应性和操作的简便性。常用方法有： 固体培养基斜面定期移植法； 石蜡油封藏法(室温下保藏)； 冷冻干燥保藏法(10下保藏)； 砂土法保藏放线菌； 麦麸皮法保藏丝状真菌等。,一种菌种保藏装置,一种简便保藏菌种的方法,几种常用菌种保藏方法的比较,
