1、自噬研究方法工具汇总- BIO-RAD细胞自噬细胞自噬(autophagy) 是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过程。这个过程可以清除功能异常的细胞器、细胞内病原体以及再循环细胞组分。尽管自噬最早被发现是应答饥饿，现在发现自噬受到各种胁迫信号的诱导，基础水平的自噬有利于细胞内稳态的维持。很多因素包括激素刺激的天然免疫信号及能量耗尽或高温等引起的物理胁迫会诱导自噬上调。相反，很多疾病如癌症、传染性疾病和神经退行性疾病及衰老和自噬的下调都有关联。自噬主要有三种信号通路： Microautophagy 小自噬通过溶酶体的膜内陷“吞入” 目标分子，起到降解细胞质中小体积物质的作用。这个过
2、程研究得不是很清楚，膜内陷相关的GTPaseVps1p 蛋白和自噬相关蛋白(Atg)参与其中。 分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediatedautophagy,CMA)直接将细胞质蛋白带到溶酶体。带 KFERQ-序列的蛋白质和热休克蛋白 Hsc70 及其它分子伴侣相互作用形成的复合体和溶酶体膜上的 Lamp-2A 受体结合后，导致 Lamp-2A 聚合引发复合体中的底物易位穿越溶酶体膜。 Macroautophagy 大自噬被研究得最多，可以降解更大量的胞浆物质，由特殊的细胞器自噬小体介导。大自噬起始于吞噬泡装配点（PAS）的形成和 Unc51-likekinase (Ulk)复合
3、体的组装，这启动了自噬小体的形成（图 1）。接着是成核阶段，Ulk 复合物与由 beclin-1、Vps15、Vps34 、Atg14 组成 classIII PI3K 复合物相互作用形成吞噬泡。接着吞噬泡膜扩展形成自噬小体，在这个过程中Atg12/5/16 复合物促成了磷脂酰乙醇胺（PE）和 LC3（酵母中是 Atg8）的偶联，这是自噬小体膜唯一已知的标志物。PE-LC3 偶联物在几个关键步骤中起作用：自噬泡膜的扩展、自噬体的识别及自噬溶酶体的形成。整个过程涉及 30 多个自噬相关基因（Atg 蛋白），包括 Beclin-1、溶酶体相关膜蛋白(Lamp-1 and Lamp-2)和微管相关蛋
4、白 1A/1Blight chains 3A/B (MAP1LC3A/B 或简称 LC3)，这些都是自噬常见的标志物。最后一步，完全形成的自噬小体与溶酶体融合释放内含的物质被降解。自噬细胞信号通路如何检测自噬？ Microautophagy 小自噬研究的工具有限，最常用的就是用电子显微镜观察溶酶体膜内陷形成的囊泡。 Chaperone-mediated autophagy (CMA) 被研究得较多，三种分子伴侣 lys-Hsc70、膜相关 Hsc70 和 lys-Hsp90 有积极参与，作为 CMA 底物受体的膜蛋白Lamp-2A 的水平可以用来评估 CMA 的活力，Lamp-2A 和 Hsc
5、70 的共定位可以用来识别 CMA-active 溶酶体。另外对于 CMA 底物的评估可参考以下方面：1. KFERQ-like targeting motif 是否出现2.与 lys-Hsc70positive 溶酶体相关联3.溶酶体活力依赖的降解速度4. 与细胞质 Hsc70 的相互作用5. 与 Lamp-2A 胞内区域相互作用 ; 6. Lamp-2A 活力相关的浓度 ;7.易位到纯化的溶酶体中的能力 Macroautophagy 大自噬的评估最好使用多个自噬阶段的标志物。因为自噬小体数量的增加可能是自噬上调也可能是自噬最后阶段被抑制，所以放置合适的对照能说明得更清楚。1.电子显微镜透射
6、电镜术(TEM)被广泛用于检测自噬过程中形成的各种结构，从吞噬泡到自噬小体到自噬溶酶体，但这个技术对使用者操作要求较高，且不能准确定量。2.检测标志物 LC3/Atg8 和 p62/SQSTM1微管相关蛋白 1A/1B light chains 3A/LC3A 和 3B/LC3B (MAP1LC3A/B), 通常简称 LC3 或酵母中称 Atg8，是自噬小体最可靠的标志物。在自噬过程中，非激活型胞质 LC3 (LC3-I) 经过水解和脂质化后转变为激活的自噬小体膜结合 LC3-II。通过 Western Blot 可以观察到更小的 LC3-II 条带, 或者通过免疫荧光或免疫组化，可观察到 L
7、C3 从胞浆转移到膜结构上。提示，自噬活跃时，LC3-II 的水平也可能低，因为自噬小体与自噬溶酶体融合后 LC3-II 会被降解。另外某些 anti-LC3 抗体识别 LC3-I 和 LC3-II 灵敏度上有差异，且LC3-I 对于反复冻融和降解更敏感即使在 SDS 上样缓冲液中，因此样品要立即煮沸使用而不要反复冻融。p62 降解是另一个常用的标志物，它在自噬清除多泛素化蛋白时会被优先降解。自噬过程中 LC3 和 p62 的转录也会被调节，因此除了检测 LC3 和 p62 的降解，还需加上其它检测。3.检测 Lamps, Atg5,Atg14, and Beclin-1针对溶酶体标志物 La
8、mp-1 和 Lamp-2, 或吞噬泡及自噬小体的标志物Atg5,Atg14,Beclin-1 的抗体经常被用在免疫荧光显微镜上、western blot 及流式细胞仪上追踪自噬过程的进展。Lamp-2 的检测应该与 LC3-II 检测联用，因Atg14 也与 ER 关联它的检测也需要与其它标志物检测联用。4.组织蛋白酶 Cathepsin 活力检测荧光标记的组织蛋白酶底物可通过报告 cathepsin B, K，L 的蛋白酶活力来发现活细胞中的溶酶体。这些可渗透细胞的无毒的试剂加入到细胞中被cathepsin 降解后产生荧光物质，与细胞核染料如 Hoechst 及溶酶体和细胞器标志物如 acridineorange 联用，可检测自噬水平。这些检测方法兼容荧光显微镜和酶标仪。5.检测自噬潮 autophagic flux因为自噬是一个动态的过程，自噬潮是一个动态连续的概念，涵盖了自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程，对这整个过程进行监测较单纯定量自噬小体的数量更能反映自噬活性。最后提醒大家，自噬和凋亡的关系很密切，例如 cathepsins 和 Beclin-1 也介导凋亡的过程，因此建议大家多使用一些标志物检测以避免得到错误的结论。
