1、在 MJ Chromo4 实时荧光系统通过反转录定量（RT-qPCR ）对基因表达进行分析反转录 定量 PCR(RT-qPCR)具有很高的灵敏性和非常好的动力学检测范围，为基因表达分析提供了一个基准。应用这一技术可以通过荧光强度变化对 PCR 反应产物进行实时监测。传统的方法，如溴化乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是 PCR 的终产物，而实时荧光定量技术能够对起始摸板进行定量，与传统方法相比实时荧光定量技术显出了极大的优势。所谓的实时荧光 定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR
2、 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图(如图 1)。图 1 实时荧光扩增曲线图一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在
3、荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（threshold value）（如图 2 所示）。CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始
4、拷贝数越多，CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图 3 所示）。因此，只要获得未知样品的 CT 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 图 3 阈值线和 CT 值对反转录定量 PCR 而言，就是定义不同处理或者不同组织间某个基因初始转录本的含量，我们可以用含有目标基因和看家基因的质粒做标准品，生成各自的定量标准曲线，再用标准曲线去定量不同样品中的目的基因的表达水平。定量的试剂包括与 DNA 双链结合的荧光染料和 TaqMan 探针、分子信标等特异性的杂交探针。与 DNA 双链结合 SYBR-GreenI(SG)
5、染料因使用简单而被许多定量实验采用。SG是一种特异结合双链 DNA 的染料，已被证明能灵敏的检测核酸。SG结合双链 DNA 后荧光增强 1000 倍左右，极为适合检测 PCR 扩增产物。由于 SG能结合于所有双链，因而不能特异性的检测某一特定模板。使用杂交探针要求细心设计引物组，而 SG仅需要两个用于扩增的引物，无需对其进行标记。DyNAzymesII 聚合酶在多种扩增反应中产生了很好的结果。这种由 Thermus brockianus中分离出来的聚合酶比 Taq 酶热稳定性更好，能在广泛的反应条件下保持很好的活性。 SG对 DyNAzymesII 聚合酶的抑制作用更小。本研究的实时定量 PC
6、R 结果表明使用 DyNAzymesII 聚合酶和 SG能够精确灵敏的检测到 噬菌体和人类基因组 DNA 的初始浓度。材料与方法材料1含有 -actin 转录本的 RNA 样品2-actin 荧光检测试剂盒（东胜创新 Chromo4 装机试剂盒）2DyNAmo SGI mix 100l5uM -actin forward primer 20l5uM -actin reverse primer 20l方法定量标准曲线的绘制1将含有 -actin 基因的质粒做系列浓度稀释，分别为 103、10 4、10 5、10 6、10 7 个拷贝。2建立 15l PCR 反应体系2 DyNAmo SGI mi
7、x 7.5l5uM -actin forward primer 1.5l5uM -actin forward primer 1.5lddH2O 3.5l-actin 标准质粒 1l每个样品做个重复SYBR Green I 荧光染料用于基因表达表达分析 1灭菌的微量离心管中加入 2ng RNA 作为模板，在 75C 加热 5 分钟，迅速置于冰上冷却。2每一反应的反应组分如下MgCl2, 25mM* 4lReverse Transcription 10X Buffer 2ldNTP Mixture, 10mM 2lRecombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor
8、0.5lAMV Reverse Transcriptase (High Conc.) 15uOligo(dT)15 Primer OR Random Primers 0.5gRNA 模板 2ngNuclease-Free Water to a final volume of 20l在 42C 下 孵育 15 分钟-60 分钟。3.上述反应液在 95C 变性 5 分钟，然后在冰上迅速冷却。4. 建立 15l PCR 反应体系first-strand cDNA reaction 1l2 DyNAmo SGI mix 7.5l5uM -actin forward primer 1.5l5uM -ac
9、tin forward primer 1.5lddH2O 3.5lNuclease-Free Water to a final volume of 15l PCR 反应1打开 Chromo4 定量 PCR 仪2. 将反应管置于循环仪中，进行板设置3如下设置程序：step 1 94 , 2minstep 96 , 10secstep 63 , 15secstep 72 , 20secstep 5plate readstep 6 84 , 1secstep plate read step 8 Goto step 2,39more timesstep 9 72 , 10minstep 10 Melt
10、ing curve analysis:65 -95 , 0.2 /read , 1 sec holdstep 11 10,foreverstep 12 开始运行结果分析1 绘制熔解曲线随着温度的升高与双链接连结合的 SG释放，荧光信号也随之平滑的下降。荧光强度随温度变化的负一次倒数也被显示。荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）处清晰地看到了一个单一的峰。这个峰对应着扩增产物的熔解温度，表明特异扩增了 -actin。荧光强度随温度变化的负一次倒数图中如没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和假阳性现象。2 绘制标准曲线C(t)值（荧光曲线与域值线交叉的点）随着初始模板
11、浓度的增加而成比例的减少，这是因为初始模板浓度高的样品更快的生成足以被 SG检测到的数量的扩增产物。 -actin 基因的标准质粒拷贝数与对应的 C(t)值成正比，具有极好的线形关系。3 未知样品中 -actin 基因转录本的定量分析对照标准曲线，依照初始模板量与 C(t)的线性关系，可轻松对 -actin 基因转录本进行定量。计算每 ng 总 RNA 中 -actin 的拷贝数。讨论实时定量 PCR 实验设计和数据分析可以采用相对定量和绝对定量两种方法，本实验中所做的是对一个样品中基因表达的绝对定量。研究人员在设计实时定量 PCR 实验分析基因表达的时候首先要问的一个问题就是：数据最后会以一个什么样的形式得到。如果需要知道绝对的拷贝数，就必须用绝对定量的方法，否则只需要给出基因表达相对量就足够了。相对定量可能比绝对定量要更容易一些，因为它不需要作标准曲线。本文所给出的公式对于每个用相对定量的方法分析基因表达差异的研究人员都足够了。下面，我们总结一下实验设计和评估中的一些重要步骤：（i） 选择一个内标基因。（ii） 确定内标的有效性，确保它不会受到实验处理的影响。（iii ） 通过 PCR 扩增目标基因和内标基因 RNA 或 cDNA 的一系列梯度稀释模板确保它们的扩增效率相同。最后通过 2-CT 计算将统计数据转化成线性形式而不是原始 CT 值
