1、专题2 微生物的利用,P191,P191,一、微生物的实验室培养 1.培养基 (1)概念:人们按照微生物对_的不同需求,配制出供其 _的营养基质。 (2)营养构成:一般都含有_和无机盐。此外还 需要满足微生物生长对_、氧气以及_的要求。 (3)种类:按照物理性质可分为_培养基和固体培养基。,营养物质,生长繁殖,水、碳源、氮源,特殊营养物质,液体,pH,P191,2.无菌技术 (1)含义:指在培养微生物的操作中,所有防止_的方法。 (2)关键:防止_的入侵。 (3)不同对象的无菌操作方法(连线):,杂菌污染,外来杂菌,P191,3.大肠杆菌的纯化培养 (1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基: 计算 _
2、 溶化 _ _,称量,灭菌,倒平板,P191,(2)纯化大肠杆菌的方法: 纯化培养原理:想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而 来的肉眼可见的菌落,即可获得较纯的菌种。 纯化大肠杆菌的关键步骤:_。 常用的微生物接种方法有两种: a.平板划线法:是通过接种环在琼脂固体培养基表面_ _,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。 b.稀释涂布平板法:是将菌液进行一系列的_,然后将 _的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培 养。,接种,连续划线,的操作,梯度稀释,不同稀释度,P191,(3)菌种的保存方法: 对于频繁使用的菌种,可以采用_的方法。 对于需要长期保存的菌种,可以采用_的方法。,临
3、时保藏,甘油管藏,P191,4,-20,二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.分离原理 土壤中细菌之所以能分解尿素,是因为它们能合成_,这种 物质在把尿素分解成无机物的过程中起到_作用。 2.统计菌落数目 统计样品中的活菌一般用_法。 3.实验流程 土壤取样_微生物的培养与观察细菌的_。,脲酶,催化,稀释涂布平板,样品的稀释,计数,P191,三、分解纤维素的微生物的分离 1.纤维素酶 (1)组成:纤维素酶是一种_,一般认为它至少包括三种组 分,即_。 (2)作用: 纤维素 _ _,复合酶,C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶,纤维二糖,葡萄糖,P191,2.纤维素分解菌的筛选 (1)原理: 纤维素分
4、解菌(2)筛选方法:_染色法,即通过是否产生_来筛选 纤维素分解菌。 (3)培养基:以_为唯一碳源的选择培养基。,刚果红 纤维素,_ 红色消失,出现_,红色复合物,透明圈,刚果红,透明圈,纤维素,P191,(4)实验流程: 土壤取样:富含_的环境 选择培养:用_培养,以增加纤维素分解菌的浓度 _:制备系列稀释液 涂布平板:将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 挑选产生_的菌落,纤维素,选择培养基,梯度稀释,透明圈,P192,1.(2012北京T5C)将转基因植物的叶片接种到无菌培养基上,应 该进行严格的无菌操作。( )2.(2012北京T5D)将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上分 离分解尿
5、素的细菌,是否无菌操作影响较小。( ),P192,3.培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种成分。( )4.筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的惟一氮源。( ),P192,5.土壤中纤维素分解菌的筛选流程中的“选择培养”是必不可 少的。( ) 【分析】土壤中纤维素分解菌的筛选流程中的“选择培养”是 否需要,应根据样品中目的菌株数量的多少来确定。 6.在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入刚果红染色剂,若出 现透明圈,则说明筛选到分解纤维素的细菌。( ),P192,7.统计样品中的活菌一般使用平板划线法。( ),P192,考点一 培养基配制 1.培养基的成分,P192,P192,P192,
6、2.培养基的分类,P192,P192,3.培养基的配制原则 (1)目的要明确:根据微生物的种类、培养目的等选择原料配制培养基,如培养自养型的微生物就不用加入有机营养物质。 (2)营养要协调:注意各种营养物质的浓度和比例。 (3)pH要适宜:各种微生物适宜生长的pH范围不同。,P192,4.培养基的制备 牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备:,P193,【思维拓展】不同生物需要的营养物质不同 (1)微生物需要的营养成分有水、无机盐、碳源、氮源,有些微生物还需要特殊营养物质,如生长因子。 (2)在人和动物中,营养物质包括水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。 (3)在植物中,营养物质包括矿质元素、水
7、、二氧化碳三类。,P193,【拓展延伸】 消毒和灭菌的比较 1.区别,P193,P193,2.联系 (1)都需借助理化性质营造微生物难以生存的不良环境。 (2)其作用原理都是通过使蛋白质变性来抑制微生物的生命活动或杀死微生物。,P193,【典例1】在农业生产中发现一种被广泛使用的除草剂(含氮有机化合物)在土壤中不易被降解,长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤,可按下面程序选育能降解该除草剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低,含一定量该除草剂的培养基不透明)。,P193,(1)制备土壤浸出液时,为避免菌体浓度过高,需将浸出液进行处理。 (2)要在长期使用该除草剂的土壤中分离出目的菌,从
8、物理性 质、用途方面来看,上述培养皿中培养基的特点是 。 (3)在划线培养时,只有很少的菌落出现,大部分细菌在此培养 基上不能生长的主要原因是 或有氧条件抑制了这些细菌的生长。 (4)在固体培养基上形成的菌落中,无透明圈菌落利用的氮源主要是 ,有透明圈菌落利用的氮源主要是 ,据此可筛选出目的菌。,稀释,在无氮固体培养基中添加了该除草剂,培养基中缺少这些细菌可利用的氮源,氮气,该除草剂,P193,(含一定量该除草剂的培养基不透明),(5)科研人员用放射线处理该细菌获得两个突变株A和B,然后对突变株A和B进行实验,结果如表所示:,突变株A不能在一般培养基上生长的原因是 。突变株A和B混合在一起接种
9、于一般培养基中能生长的最可能原因是 。,突变株A缺乏合成营养物质甲所需要的酶,突变株A生长需要营养物质甲,突变株B可以提供;突变株B生长需要营养物质乙,突变株A可以提供,P193,考点二 微生物的纯化培养技术 1.原理 在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞,使其长成单个的菌落,这个菌落就是纯化的细菌菌落。,P193,2.微生物接种方法 (1)平板划线法:平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中。在线的开始部分,微生物往往连在一起生长,随着线的延伸,菌数逐渐减少,最后可能形成纯种的单个菌落。(如图所示),P193,(2)稀释涂布平板法:10倍系列稀释操作。
10、将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌,并按101106的顺序编号。 进行梯度稀释后,从菌落开始,每次取前面1 mL溶液注入到下一试管中混匀。(如图所示)进行涂布平板操作。,P193,【高考警示】 (1)两种接种方法作用不完全相同:平板划线法和稀释涂布平板法都能使细菌纯化,但平板划线法不易分离出单个菌落,不能计数;稀释涂布平板法能使单菌落分离,便于计数。 (2)稀释涂布平板法的缺点:稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。,P194,(3)平板划线法纯化大肠杆菌时不同阶段灼烧接种环的目的不同: 第一次操作:杀死接种环上原有
11、的微生物。 每次划线之前:杀死上次划线后接种环上残留的菌种,使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。 划线结束后:杀死接种环上残存的菌种,避免细菌污染环境和感染操作者。,P194,【典例2】从自然界微生物中筛选某菌种的一般步骤是:采集菌样富集培养纯种分离性能测定。 (1)不同微生物的生存环境不同,获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样,然后再按一定的方法分离、纯化。培养嗜盐菌的菌种应从 环境中采集。 (2)富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件,使其菌落中的数量大大增加,从而分离出所需微生物的培养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择 的培养基,并在 条件下培养。
12、,海滩等高盐,以淀粉为惟一碳源,高温,P194,(3)接种前要对培养基进行 处理。在整个微生物的分离和培养中,一定要注意在 条件下进行。 (4)如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图,请分析接种的具体方法。,高压蒸汽灭菌,无菌,P194,获得图A效果的接种方法是 ,获得图B效果的接种方法是 。一同学用稀释平板法纯化土壤中的细菌时,发现培养基上的菌落连成一片,最可能的原因是 ,应当怎样操作才可避免此现象? 。 (5)如果探究温度对纤维素酶活性的影响,自变量是 ,应该保持 等不变(至少答两项)。,稀释涂布平板法,平板划线法,菌液浓度过高,增大稀释倍数(或培养过程被杂菌污染 严格无
13、菌操作),温度,纤维素的量与浓度、反应时间、pH,P194,考点三 微生物的筛选与计数 1.筛选菌株 (1)原则:人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等),同时抑制或阻止其他微生物的生长。,P194,(2)菌株筛选原理的比较:,P194,CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2,脲酶,用伊红美蓝培养基鉴别大肠杆菌，大肠杆菌菌落呈现黑色,2.统计菌落数目的方法 (1)显微镜直接计数法: 原理:利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。 方法:用计数板计数。 缺点:不能区分死菌与活菌。,P194,(2)间接计数法(活菌计数法): 原理:当样品
14、的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。 计算公式:每克样品中的菌株数=(CV)M,其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M代表稀释倍数。 操作:设置重复组,增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确,一般选择菌落数在30300的平板进行计数。,P194,3.设置对照 (1)目的:排除实验组中非测试因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度。 (2)方法:证明培养基未被污染,用空白培养基作对照。 证明选择培养基的选择作用,用牛肉膏蛋白胨培养基接种
15、等量同种菌液作对照。,P194,【高考警示】 (1)为了使结果接近真实值,应设置三个或三个以上的平板,计算出菌落平均数。 (2)计算时明显偏离实际值(本组实验其他平板计数值)的要舍弃掉后求平均值。 (3)对照实验的设计首先要明确设计的目的,分析出实验的自变量之后才能准确设计。,P194,【典例3】下面是探究如何从土壤中分离出自生固氮菌与计数的实验,完成下列问题: 实验原理:农田的表层土壤中,自生固氮菌的含量比较多。将用表层土壤制成的稀泥浆,接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下,只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法,可以将自生固氮菌与其他细菌分离。 材料用具:农田的表层土壤、无氮培养基、牛
16、肉膏蛋白胨培养基、盛有9 mL无菌水的试管、无菌吸管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛有90 mL无菌水的锥形瓶、恒温箱。,P194,(1)方法步骤: 倒平板:分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板,应在 操作。 制备土壤稀释液:取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中,充分摇匀。用无菌吸管吸取上清液1 mL,转至盛有9 mL的无菌水的试管中,依次稀释到107稀释度。 涂布:按照由107103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布,每个稀释度下,无氮培养基应至少涂布 个平板,牛肉膏蛋白胨培养基涂布 个。,酒精灯火焰旁,3,1,P194,培养:放入恒温箱内,在2830下培养3 d4
17、d。 细菌的计数:当菌落数目稳定时,选取菌落数在 的平板进行计数。如果测定的平均值为50,则每克样品中的菌落数是 。(稀释度是105) (2)预期结果:相同稀释度下,牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数(选填“多于”或“少于”)无氮培养基上的数目。原因是_ _。,5107,30300,多于,无氮培养基上只有土壤中的自生固氮菌能生存繁殖,而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类生存,(500.1)105=5107,P195,【互动探究】 (1)据上题可知,在稀释涂布平板法中,为何需涂布三个平板? 提示:对照作用、减少实验误差等。一是作为对照实验,判断实验操作的准确性;二是作为重复实验,统计时取平均值
18、,以减少实验误差。 (2)用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目,其结果与实际值相比如何? 提示:比实际值低。培养基上的一个菌落也可能是相连的两个或多个细胞,而统计结果一般用菌落数来表示,因此统计的菌落数要少于活菌的实际值。,P195,【变式训练】植物的秸秆、枝叶等纤维物质是地球上最多的可再生资源,以纤维素类物质生产燃料乙醇的研究越来越受重视。纤维素酶糖化法是目前常用的方法,其操作过程如图所示:,P195,(1)该方法中,常用的微生物Y是 ,若从土壤中获得微生物X,请写出分离的流程图: 。为了鉴别微生物X,培养基的成分为CMC-Na、酵母膏、KH2PO4、琼脂、土豆汁等;在该培养基中,CMC-
19、Na的作用是 。,酵母菌,土壤取样选择培养梯度稀释将菌液涂布到特定的选择培养基上挑选产生透明圈的菌落,提供碳源(或便于鉴别),P195,是天然纤维素经化学改 性后得到的纤维素衍生物,(2)若经选择,微生物X为木霉,则其内分解纤维素的酶至少包括 _三种组分,这三种酶为协同作用,将纤维素分解为葡萄糖。 (3)在操作过程中,过程需 以保证乙醇的产生。 (4)操作发现,糖液浓度过高时,葡萄糖的产生会受到抑制,其原因是 。,C1酶、Cx酶、葡萄糖苷酶,密闭发酵,产物(葡萄糖)过多,反馈抑制了分解秸秆的酶的活性,P195,1.下表是一种培养基的配方,请回答:,(1)该培养基从物理性质来说,属于 培养基。,
20、固体,P195,(2)无菌操作是微生物培养最基本的要求,其中灭菌指的是 _。 对于培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌和消毒方法依次是 。(填代号) 化学消毒 灼烧灭菌 干热灭菌 紫外线灭菌 高压蒸汽灭菌 巴氏消毒法 (3)在平板划线法中,每次灼烧接种环后,为什么要等其冷却后再进行划线? 。,以免接种环温度太高,杀死菌种,使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子,P195,(4)稀释涂布平板法统计菌落数目时,一般选择菌落数在_ 的平板进行计数,在某一稀释度下平板上的平均菌落数为100个,所用稀释液的体积为0.2 mL,稀释倍数为105时,则每毫升样
21、品中的菌落数为 。 (5)以尿素为惟一氮源的培养基中加入 指示剂,培养某种细菌后,如果pH升高,指示剂将 ,利用这一特点,可准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。,5107,30300,酚红,变红,(1000.2)105 =5107。,P195,2.大肠杆菌是“明星菌”,在生物技术上常被称为“工程菌”。某生物小组的同学利用实验室提供的某品系大肠杆菌及其他必需材料,对该品系大肠杆菌进行了培养、计数。 (1)大肠杆菌在生长过程中对各种营养成分所需的量不同,故制备培养基时各营养成分要有合适的 。 (2)在制备固体培养基进行倒平板操作时,平板冷凝后,甲同学将平板倒置,其原因是 。(3)乙同学采用平板划线法接
22、种,获得单菌落后继续筛选,在每次划线之前都要灼烧接种环,其目的是 。,比例,培养皿上会凝有水珠,平板倒置可防止水珠落入培养皿中而造成污染,还可使培养皿表面的水分更好的挥发,杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种,P195,(4)丙、丁同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中,得到以下两种统计结果:丙同学在该浓度下涂布了一个平板,统计的菌落数为230;丁同学在该浓度下涂布了3个平板,统计的菌落数分别为21、212、256,然后取其平均值163作为统计结果。请评价这两位同学的实验结果的有效性: 丙同学的结果 ,原因是 。 丁同学的结果 ,原因是 。 (5)戊同
23、学在测定大肠杆菌的密度时发现培养基上还有其他杂菌的菌落,由此他判断该品系大肠杆菌被污染了。他的判断是否确切?为什么? 。,不确切。因为不能确定杂菌是来自培养基还是来自培养过程,无效,无效,没有设置重复组实验,结果不具有说服力,一个平板上的菌落计数结果与另外两个相差太大,P195,3.白僵菌高孢粉是国家林业局推广的高效生物杀虫剂之一,应用于多种林木和农作物害虫的防治。白僵菌分生孢子附着在宿主表皮、气孔或消化道上,遇适宜条件开始萌发,生出芽管。同时产生脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶等溶解昆虫的表皮,通过芽管入侵虫体,在虫体内生长繁殖,消耗宿主体内养分,产生各种毒素,形成大量菌丝和孢子,布满虫体全身。请回
24、答下面的问题:,P195,(1)从自然菌样中筛选较理想生产用菌种的一般步骤是:采集菌样富集培养 性能测定。白僵菌的菌样应从 采集。 (2)分离白僵菌菌种的培养基属于 培养基。在配制白僵菌培养基时加入蔗糖、硫酸铵、硝酸钾等成分,蔗糖属于 营养物质。 (3)白僵菌纯化培养时常用的接种方法是 和 。 (4)分离与培养过程中,培养基和接种工具都要进行 处理,利用高温可以使微生物的 等物质发生变性。,蛋白质和核酸,纯种分离,感病昆虫体内,选择,碳源,平板划线法,稀释涂布平板法,灭菌,P195,【方法技巧】选择培养基的使用方法 (1)在培养基中加入某种化学物质: 例如,加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌;加
25、入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在主要营养成分完整的基础上加入。 (2)改变培养基中的营养成分: 例如,缺乏氮源时可以分离出固氮微生物;石油作为惟一碳源时,可以分离出消除石油污染的微生物。 (3)改变微生物的培养条件: 例如,将培养基放在高温环境下培养,可以得到耐高温的微生物。,P195,4.(能力挑战题)(2013泰州模拟)研究发现乳酸菌素(小分子蛋白质)有抑菌作用,它的提取及应用如图所示。(1)对新配制的培养基灭菌时所用的设备是 。实验前需对超净工作台进行 处理。无菌技术要求实验操作应在酒精灯 附近进行,以避免周围环境中微生物的污染。,高压蒸汽灭菌锅,紫外线消毒,火焰,P195,(2)乳酸菌是异养厌氧型微生物,培养基中的尿素可为乳酸菌A的生长提供 。 (3)电泳法纯化乳酸菌素时,若分离带电荷相同的蛋白质,则其相对分子质量越大,电泳速度 。 (4)进行抑菌实验时,在长满致病菌的平板上,会出现以抑菌物质为中心的透明圈。可通过测定透明圈的 来说明乳酸菌素的抑菌效果。,大小,碳源和氮源,越慢,P195,
