1、艾滋病实验室检测,郭志宏 （0571-87115197） 浙江省疾控中心 艾滋病确证中心实验室,内容提要：,1.艾滋病实验室检测目的、方法。 2.艾滋病检测样本的采集和处理。 3.HIV抗体检测方法目的要点和流程。 4.HIV抗体快速检测方法原理应用评价。 5.艾滋病抗体检测结果的处理及应用。 6.HIV-1抗原检测 7.HIV核酸检测 8.HIV-1耐药检测 9.CD4/CD8+T淋巴细胞检测,1、艾滋病检测的医学目的,个体：诊断感染状态，感染者知道自己的感染情况，减少传播，及时寻求治疗。 传染病管理：疾控机构及时的发现传染源、配偶（固定性伴）的检测、随访和干预，发现管理感染者、提供关怀服务
2、。 医疗机构：及时的医疗服务和医源性感染的预防,1.1HIV相关检测方法,A 常用HIV病原学检测方法:核酸检测（ 定性、定量）、P24抗原检测、病毒培养分离 B 常用HIV抗体检测方法:初筛：1.酶联免疫吸附法 ELISA：第三代、第四代。2.快速检测 RT：金标、硒标。3.简单法 PA: 明胶颗粒凝集确证：免疫印迹法 WB、RIBA C 其他相关检测方法: 免疫功能测定：CD4/CD8检测,2、样品的采集和处理,2.1样品的种类和用途： 1 HIV抗体检测：全血、血清、血浆、唾液、尿液以及DBS样品。 2 CD4+T淋巴细胞测定：抗凝全血。 3 HIV-1病毒载量：血浆。 4 HIV-1核
3、酸的定性检测和基因型耐药检测：全血、血浆、PBMC及DBS样品。 5 HIV分离培养：PBMC、全血。,2.2样品的保存 1 用于抗体和抗原检测的血清或血浆样品，1周内可存放于28， 一周以上应存放于-20以下。 2 用于核酸检测的血浆和血细胞样品4天内检测可存放于4，3月内存放-20以下。3月以上应置-70以下。 3 用于CD4检测的全血可存放于室温（1825） ，一般当天送检。 4 阴性样品至少保存12个月。阳性样品保存至少10年。,2.3 样本运输 1. 应采用三层容器包装。 2. 用于抗体检测的血清和血浆样品应在冷藏下（28）运送。用于CD4+和CD8+T淋巴细胞测定的样品应在室温下（
4、1825）运送。用于病毒载量检测的样品应在-20以下运输。DBS样品应在室温下（1825）运送。,3、HIV抗体检测方法,检测HIV抗体是HIV/AIDS诊断的一项重要指标，HIV抗体测定作为血清学诊断要求准确、可靠，经初筛、复检试验和确证实验三个步骤。3.1 HIV抗体检测目的HIV抗体检测可用于诊断、血液筛查、监测等。,1 根据目的选择检测方法及检测策略。 2 严格遵守实验室SOP。 3 筛查试验阳性，须作确证试验。 4 筛查试验阴性， 不应做确证试验。 5 筛查及确证试验阳性均应做好咨询工作。,3.2 HIV抗体检测的要点,样品,初筛试验,筛查试剂,阳性反应,阴性反应,复检试验,原有试剂
5、,+,另一不同原理,（,或厂家,）,试剂或另外两种,不同原理,（,或厂家,）,试剂,均阳性反应,一阴一阳,均阴性反应,确证试验,报告阴性,图,1,HIV,抗体筛查检测流程,3.3HIV抗体筛查检测流程,初筛试验,1、HIV抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复检）和确证试验。 2、根据检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛检测，对呈阴性反应的样品，可出具HIV抗体阴性（-）报告；对呈阳性反应的样品，需要进一步做复检试验和确证试验。,复检试验,使用原有试剂和另外一种不同原理或另外两种不同原理（或厂家）的试剂进行复检。如两种均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性（-）；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需
6、进行确证试验。如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，则复检必须包括一种抗原抗体联合试剂。如果抗原抗体联合试剂检测呈阳性反应，而抗体试剂检测为阴性反应，则应考虑进行HIV-1 p24抗原或核酸检测，必要时进行随访。,筛查试验呈阳性反应样品的转送,筛查试验呈阳性反应样品，需要核对身份，补充个人信息（如姓名和身份证号码），采集第二份血样，持HIV抗体筛查报告，送当地艾滋病筛查中心实验室，或直接送确证实验室。,确证试验,1 确证试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。 2 确证样品可采用血清、血浆、滤纸干血斑样品。 3 确证方法包括免疫印迹试验（WB）、条带免疫试验（RIPA） 、放
7、射免疫沉淀试验及免疫荧光试验（IFA）等。,3.4孕产妇新生儿抗体检测流程,3.5艾滋病检测实验室检测信息上报,各级艾滋病检测实验室所在机构每月应填写HIV抗体检测数及阳性人数统计报表（附表6），并于每月10日前完成网络直报。未开展网络直报的单位，由县级疾病预防控制机构收集信息后统一上报。,4、艾滋病快速检测试验（RT）,是ELISA发展起来的一种检测技术，它用胶体金或硒标记抗原、抗体后以层析方法进行检测。 突出优点为快速、试剂便于保存、检测不需要特殊设备并可以单份检测 ，比较适用于基层医疗单位和标本初筛。 挑战：进一步提高检测灵敏度和特异性，减少批间差异，提高试剂质量。,4.1艾滋病快速检测
8、：胶体金（或胶体硒）原理和方法,原理 包括HIV-和HIV-2抗原直接包被于硝酸纤维素膜上的检测线，将HIV抗体包被于质控线，通过利用胶体金(或胶体硒）标记HIV-1 和HIV-2抗原,采用免疫层吸双抗原夹心法原理来检测待测样品中可能存在的HIV抗体。 操作方法 操作简单，只需在加样处加上样品。,4.2艾滋病快速检测试剂构造,4.3艾滋病快速检测：胶体金（或胶体硒）结果判读,结果判读 反应区和质控区均出现红色条带为阳性。质控区有条带，反应区无条带为阴性。反应区和质控区均无条带则实验无效。,4.7快速试剂使用中存在的问题,快速检测只是初筛检测，存在较高的假阳性和假阴性； 技术上属于主观判读，不具
9、备标准化条件； 存在较大的批间误差，风险较大； 担心敏感性不够高，不敢出阴性报告。,4.8艾滋病快速检测注意事项,不提倡个人在家中检测。应由经培训的专业人员操作，注意生物安全操作，避免职业暴露发生。 在质控窗口内未呈现红色质控带，说明质控无效，该试验结果无效，样品须重检。 出现以下问题，提示存在质量隐患，应引起重视：运输包装、内盒或试剂盒的物理损伤；标签出现错误、缺失或字迹模糊 ；不适宜的存放条件；,5、HIV抗体检测结果的分析应用,1.输血和移植安全（为了接受者的安全） 2.监测(为了知晓人群流行状况) 3.临床HIV疾病的诊断和VCT检测 (为了知晓个体感染状况）为了达到以上的某个目的的H
10、IV 检测可能不适合其他目的，比如输血服务的检测不适合临床诊断HIV感染,5.1HIV抗体检测结果的报告和处理,HIV抗体阴性： 可报告阴性，如近期有高危行为，在最后一次高危行为3个月时复查。 HIV抗体初筛阳性：核对身份并重新采血样，将血样和HIV抗体初筛阳性送检化验单一起送确认。应进行筛查阳性咨询。 HIV抗体确认阳性：尽快向有关部门报告疫情并做好阳性告知，注意保密。 HIV抗体确认不确定：定期随访，仍可疑可报阴性。必要时作核酸和抗原测定。,5.2HIV抗体检测不确定,定义：WB缺少符合阳性诊断标准的条带。一般出现一条或几条GAG或POL条 带或仅一条ENV。 原因：正处于血清阳转的初期感
11、染。对宿主蛋白的非特异反应,5.3不确定结果的预防和处理,初筛阳性标本应使用不同原理的试剂复检。 WB试验不确定，4周后复检。 也可选用其他确认试剂，如IFA、RICP 反复初筛阳性反应，而WB阴性或不确定可认为假阳性。 如抗原抗体联合试验阳性，但WB阴性和不确定，注意流行病学资料，建议随访或开展核酸检测。,6、HIV-1抗原检测,（一）HIV-1抗原检测的用途HIV-1感染窗口期、HIV抗体不确定或HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断。第四代HIV检测试剂的阳性结果的辅助诊断。监测病程进展或抗病毒治疗效果。HIV分离培养，病毒复制状况的监测。,6.1HIV-1抗原检测方法和结果报告,方法：E
12、LISA，有定量检测。 HIV-1 P24抗原筛选试验有反应的标本必须经过中和试验确证。 HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助诊断依据，不能据此确诊。 HIV-1 P24抗原阴性不能排除HIV感染。 监测病程进展或抗病毒治疗效果应进行HIV-1 P24抗原的定量检测。,7、HIV核酸检测的意义,早期诊断：不同时间的两次HIV核酸检测结果均为阳性，即可诊断。HIV抗体阴性的高危人群样品进行集合核酸检测，及时发现窗口期感染。 疑难样本的辅助诊断：帮助提供HIV感染早期或终末期的证据。 耐药性监测：了解耐药性病毒株流行的态势和指导临床医生判断抗病毒治疗效果和修改抗病毒治疗方案。 病程监控
13、及预测：确定疾病发展确定治疗方案。指导抗病毒治疗及疗效判定,7.1核酸检测内容,集合核酸定性检测 （Pooling PCR）对高度怀疑人群抗体阴性的样品进行集合核酸检测，可及时发现窗口期感染者。 婴幼儿HIV感染核酸检测 HIV感染产妇所生婴幼儿在出生后18个月内可应用HIV核酸（DNA或RNA）检测进行早期HIV感染诊断。HIV DNA检测不受母亲围产期抗逆转录病毒治疗和人乳汁中抗逆转录病毒药物以及婴幼儿预防性抗逆转录病毒治疗的干扰而影响。,7.2婴幼儿HIV感染的诊断,HIV DNA PCR实验是婴儿HIV感染诊断首选的方法 38感染的孩子在出生后48小时HIV DNA PCR就可呈现阳性
14、 在出生后第二周，检测的敏感性大幅度上升，14天时阳性率达到93。28天时阳性率是96，并且具有很高的特异性（大约99）,HIV感染早期诊断检测流程,8、HIV-1耐药检测,8.1 耐药监测 用于HIV-1感染人群和抗病毒治疗人群。了解耐药毒株流行的情况；指导制定一线和二线抗病毒治疗方案；进行HIV-1耐药发生、发展趋势以及影响因素的分析，指导和完善大规模公共卫生模式抗病毒治疗的程序。 8.2 耐药检测 用于个体患者。在抗病毒治疗前进行耐药检测，可指导临床医生制定抗病毒治疗方案，保证抗病毒治疗的效果；指导临床医生分析治疗失败的原因，并制定补救治疗方案。,基因型耐药 直接测序程序,9、CD4+和
15、CD8+T淋巴细胞检测,采集样本用的抗凝剂：K2EDTA、K3EDTA 一般要求48小时内染色，染色后6小时内分析。如采血后24小时内染色，则可在染色后24小时内分析。如果利用CD45单克隆抗体和侧向光设淋巴细胞门，可检测放置72小时的样品。 在室温（1825）保存和运输样品，避免极端温度（结冰或大于37）。高温季节，需用隔热容器盛装样品，并将其置于有冰袋和吸热物质的容器中。,流式细胞术,液流系统 光学系统 激光光源 光收集系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 软件系统,当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区 受激激发产生代表细胞内不同波长的荧光信号,这些信号经A/D转换成数字信号, 送计算机进行储存、作图、统计分析,
