1、内容,模块一 工业微生物及来源、分离、选育,1. 生物活性物质产生菌的筛选；,2. 寻找产生目标或所需生物活性物质的微生物（菌种）：确 定其来源；,3. 新种的分离：把混杂的各类微生物单个分开。,原则：根据生产实际要求和菌种特性，灵活地、有的放矢 地采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需的菌种挑选出来：获得纯种。,模块一 工业微生物及来源、分离、选育,4. 生产菌种的获得；,5.育种或选育；,一、生物活性物质产生菌的筛选,1. 般新种分离纯化和筛选步骤,采样,预处理,增殖或富集培养,纯种分离,性能测定,稀释,划线,组织分离,初筛,复筛,一、生物活性物质产生菌的筛选,2. 产生目标或所需生物活性
2、物质的微生物（菌种）的来源,土壤、海洋、空气、某些特定的环境,二、微生物选择型分离的原理,（3）抗生素或试剂；（P32）,1. 新种的分离,1.1 预处理；（P31）,1.2 施加选择性压力分离法；,（1）环境条件：温度、pH、渗透压、氧气等；,（2）碳源、氮源（培养基）；（P32）,二、微生物选择型分离的原理,（4）培养方法：分批式富集培养（摇瓶培养），恒化式富集 培养（连续培养）（P34）,1.3 随机分离法；（P35）,（1）抗生素产生菌的筛选；,（2）药理活性化合物(酶抑制剂)的筛选；,（3）生长因子产生菌的筛选；,上述两种方法的目的是富集和增殖，使所需微生物在混合物中形成优势， 已达
3、到某种程度的初筛效果，便于后续纯种分离。,二、微生物选择型分离的原理,纯种分离方法：稀释分离法、划线法、组织法。,另一类是较细的单细胞或单孢子分离方法，可达到“菌株纯”或“细胞纯”的水平。,粗放，只能达到“菌落纯” （工业上常采用）,可达到“菌株纯”或“细胞纯”的水平。需采用专门的仪器设备，复杂：显微操作装置， 简单：利用培养皿或凹玻片作分离小室进行分离。,二、微生物选择型分离的原理,分离时为提高筛选工作效率，仍要引入各种选择性压力。,2. 对纯种进行发酵条件的摸索和生产试验（生产性能测定）。,此处可加一步产物鉴别,此步骤要反复进行，直至获得 13株 较好的、 适合生产要求的菌株， 并进而将其
4、作为育种的出发菌株。,二、微生物选择型分离的原理,（1）生产性能测定分初筛和复筛两步进行。,（2）初筛阶段的主要矛盾：菌株多，工作量大；准确性是次要矛盾。,（3）初筛原则：多选菌株，一个菌株做一个发酵。,（4）复筛阶段：8090%的菌株在初筛阶段被淘汰，生产性能和准确性为主要矛盾。,5）复筛原则：一个菌株同时做35个发酵，必要时可连做几批。,应把握工作量和准确性这对矛盾的“度”。,三、菌种选育,改造菌种，目的：大幅度提高产量，改进质量。,1. 出发菌株的选择原则,（1）自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果；,（2）在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是 良好的
5、出发菌株；,三要素：出发菌株 、育种手段 、筛选条件。,（3）每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高；,（4）出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比较后，将 更适合的出发菌株留作继续诱变；,（5）要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高 产基因。,2. 工业菌种育种的手段：,自然选育（P36）,诱变育种（P3741）,杂交育种（P4348）,原生质体融合（P48）,基因工程育种（P58）,诱变育种举例-营养缺陷型,与营养缺陷型对应的是野生型。,MM：能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基 。,SM：在基本
6、培养基中加入相应的营养成分的称补充培养。,CM：能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基。如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。,是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质 如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中 加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。,诱变育种举例-营养缺陷型,筛选营养缺陷型的步骤,诱变,淘汰野生型,检出缺陷型,确定生长谱,1、诱变方法：物理诱变和化学诱变。,诱变育种举例-营养缺陷型,2、淘汰野生型,目的：浓缩缺陷型。,采用的手段或方法：,野生型 MM,而缺陷型 MM, 抗生素法：,将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长， 处于活化阶段，而缺陷型无法生长，处于休
7、眠状态。,诱变育种举例-营养缺陷型,细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。, 菌丝过滤法：适合丝状菌,对于丝状菌，在MM上会形成菌丝体，就不能通过过滤介质，而缺陷型因未生长而能通过滤层。,能否浓缩的关键是细胞在MM中生长的情况。,细菌或酵母对一些抗生素敏感，加入一定量 的抗生素，使活化状态的野生型就被杀死， 缺陷型因因不能生长繁殖而保存下来。,诱变育种举例-营养缺陷型,3、检出缺陷型,采用的方法：,影印法、点种法、夹层法。,缺陷型在CM上生长良好，在MM上则不生长， 野生型二者均能生长。,诱变育种举例-营养缺陷型,影印法,1. 将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒， 用金属夹夹
8、住，灭菌；,2. 将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压， 使之成为印模，标记方位；,3. 将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上 先后轻轻一压，此菌印模即复印于上；,诱变育种举例-营养缺陷型,4. 将CM和MM在恒温箱中培养；,5. 二平皿相同方位进行比较，可发现在 MM平皿上长出的 菌落少于CM平板上的。MM上未长而相应于 CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。,诱变育种举例-营养缺陷型,点种法,夹层法,用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种， 依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。 此法结果明确，但工作量大。,先在培养皿上倒一层M.M.琼
9、脂培养基，凝固后涂上一层含菌的M.M.， 培养24h，将长出的野生菌落标记。,然后倒上一层C.M.琼脂培养基，再培养。 这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。,诱变育种举例-营养缺陷型,4、营养缺陷型生长谱的确定,生长谱测定的方法：,结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。,验证确定是缺陷型后，需确定其缺陷的因子，即生长谱的测定。,诱变育种举例-营养缺陷型,方法一：菌体 MM 组合营养物,将缺陷型菌株培养后，离心收集菌体，制备成细胞悬液， 与M.M.培养基（融化并凉至50）混合并倾注平皿。,待凝固后，分别在平皿的56个区间放上不同的营养组合 的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。
10、,培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。个平皿测一个菌。,诱变育种举例-营养缺陷型,方法二：组合营养物 MM 菌体,以不同组合的营养混合物与融化凉至50的M.M.培养基混合铺成平皿。,然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置。,培养后根据在这些组合长出情况可推知其营养因子。,在56个平皿上可测20株菌以上。,工业化菌种的要求,6.生产特性要符合工艺要求。,1. 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物；,2. 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种 改造的可操作性要强；,3. 遗传性能要相对稳定；,4. 不易感染它种微生物或噬菌体；,5. 产生菌及其产物的毒性必须
11、考虑（在分类学上最 好与致病菌无关）；,杂交育种,利用不同变种的细胞与细胞结合、染色体的交换、 基因的重组来获得优良品种的过程。,目的：是把双亲（或多亲）的不同遗传性状集中到杂种个体中， 以创造出具有双亲（或多亲）的优点，或获得不同于亲代遗传性状的杂种。,杂交育种的理论基础：基因重组。,杂交育种中最有实践价值和理论意义： 提高了杂种对诱变剂的敏感性。,杂交育种举例霉菌的体细胞杂交,准性生殖：,霉菌杂交：指通过体细胞的核融合和遗传因子的重组， 即通过准性过程而不是通过性细胞的融合。,工业上遇到的霉菌大多数不产生有性孢子，没有典型的有性过程。 细胞杂交得到的分生孢子还是无性孢子，形态上无特殊变化。
12、,准性循环（体细胞杂交）的三个连续过程，见下 图。,图 1 霉菌的准性循环,霉菌的体细胞杂交,1.选择直接亲本,原始亲本,用来进行杂交的两个野生型菌株。,直接亲本,原始亲本经诱变后得到各种突变型菌株，若用来作为形成异核体的亲本。,2.异核体的形成,两株遗传标记不同的菌株，经过菌丝间的吻合，细胞质和核进行交流，形成异核菌丝体（简称异核体） 。,霉菌的体细胞杂交,3. 杂合二倍体的形成,是准性重组的主要部分，也是杂交育种的关键。,此时一条菌丝里含有两种遗传性状不同的细胞核， 共同生活在均一的细胞质里。,异核体具有野生型的功能，并非所有的菌株都有形成异核体的能力， 只有彼此间具有感受性才能形成异核体
13、。 技术见（P47）,杂合二倍体本身不仅具备了杂种的特性，而且随着其染色体 或基因的重组和分离，还能形成更多类型的杂种（重组体分离子） 为杂交育种和遗传分析提供了丰富的材料。,霉菌的体细胞杂交,杂合二倍体的形成方法见（P47）。,4. 染色体交换及单倍化（体细胞重组）,杂合二倍体是相对稳定的。,重组型分离子即重组体，在二倍体菌落中表现为角变和扇形斑点。分离子检出方法见（P47）,有极少数的体细胞在它们无性繁殖的有丝分裂过程中偶然发生染色体交换 （体细胞交换）和染色体单倍化（不同于减数分裂）， 产生单倍或双倍的分离子。表型上可分为亲本型分离子和重组型分离子。,霉菌的体细胞杂交,准性生殖和有性生殖
14、的相同点：,相类似遗传现象：核融合、形成杂合二倍体、染色体再分离、同源染色体交换、出现重组体；均能导致基因重组。,不同点：,有性生殖通过减数分裂，准性生殖通过体细胞交换和单倍化。,青霉素产生菌产黄青霉与灰黄霉素产生菌荨麻青霉 双重营养缺陷型间准性杂交,见 图 2,图 2-2 青 霉 菌 杂 交 育 种 实 验 操 作 步 骤,原生质体融合技术（P48）,原生质体制备（破壁）,原生质体融合（化学融合、电融合）,原生质体再生（高渗）,融合子的检出（遗传标记、选择性培养基）,重组DNA技术：,DNA重组技术、基因工程（P4958）,是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一
15、种生物体（受体）内；,使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。,重组DNA技术的三大基本元件：,供体、受体、载体。,基因工程,是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和 下游技术两大组成部分。,上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组 DNA技术）；,下游技术：基因工程菌或细胞的大规模培养，基因产物的 分离纯化过程。,常用的获得目的基因的方法：,鸟枪法、cDNA法、人工合成（P52）。称之谓“切”。,载体：质粒、噬菌体、其它载体。（P5354）,基因与载体的连接技术：黏性末端连接和平头连接（钝端连接）。称之谓“接”。（P54
16、）,接头（Linker）：是使两种DNA片段连接起来时所使用的核苷酸链。,黏性末端连接：属于分子内部的连接。,平头连接：属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。,连接酶：常用噬菌体T4DNA连接酶。,转化：是指细胞在一定生理状态（感受态）时可摄取外源遗传 物质，并经体内重组；,连接方式,使之成为其染色体的一部分，导致受体细胞某些遗传性状发生 改变。 称之谓“转”。,实现转化的主要方法：,感受态细胞转化、原生质体转化、碱土金属离子处理。（P55）,增：PCR扩增。,检：重组体的筛选与表达产物的鉴定。（P55）,遗传学直接筛选法：抗药性检测、噬菌斑形成；,分子生物学间接法：电泳（酶切相对分子量）、分子杂交（区带杂交和原位杂交）。（P56）,表达产物的鉴定：DNA序列测定；产物鉴定；功能互补。,工程菌的稳定性问题（P56）：,质粒不稳定和表达产物不稳定；,质粒不稳定又分为分裂不稳定（子代菌不含质粒）和结构不稳定（外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失）。,常见的是分裂不稳定。,菌种保藏（P58）,
