1、产前分子 诊断 中需要注意的若干问题武 汉 大学中南医院 产 前 诊 断中心武 汉 大学中 南医院 临 床基因 诊 断中心 /检验 科郑 芳产 前 诊 断基本概念染色体核型分析NIPT/CNV巨 细 胞病毒的 检测目 录产 前 诊 断 ，又称 宫 内 诊 断或 出生前 诊 断，是 对 胚胎或胎儿是否患某种 严 重遗传 病或先天性畸形做出 准确 诊 断 ，以 预 防患儿的出生，是 预 防 优 生学的重要 组 成部分。一、 产 前 诊 断的基本概念（一）（一） 产产 前前 诊诊 断的定断的定 义义（一）（一） 产产 前前 诊诊 断断 的意的意 义义1.优 生的重要措施，减少出生缺陷，提高全民素 质
2、2.减 轻 家庭及社会的 经济负 担3.阻断致病 基因在家族中的 传递4.给 孕 妇 有更大的空 间 和更多的 选择 ， 对 于高危孕 妇 同 样 可以 怀 孕并且得到一个健康的小孩5.考 虑 要保存患病胎儿的孕 妇 ， 提供 宫 内治 疗 的 可行性 ， 提供良好的 产 前治 疗依据一、 产 前 诊 断的基本概念筛查 / 诊断筛查 /诊断新生儿筛查筛 查 /诊断三 级预防一 级预 防 二 级预防产前孕 前 植入 前一、 产 前 诊 断的基本概念出生缺陷的三级预防（三）产前诊断（三）产前诊断 的指征的指征 35岁 以上 的高 龄 孕 妇 羊水 过 多 的孕 妇 有原因不明的 习惯 性流 产 史
3、的孕 妇 具有 遗传 病 家族史，或系 近 亲 婚配 的孕 妇 X连锁遗传 病基因 携 带 者孕 妇 夫 妇 之一有 致畸因素 接触史的孕 妇 夫 妇 之一有染色体畸 变 ，特 别 是 平衡易位携 带 者 ；夫 妇 核型 虽 正常，但生育 过 染色体病患儿 的孕 妇 。 夫 妇 之一有 开放性神 经 管畸形 ，或是生育 过这 种畸形儿的孕 妇 夫 妇 之一有 先天性代 谢 缺陷 ，或生育 过这 种患儿的孕 妇一、 产 前 诊 断的基本概念（ 四） 产前诊断技术产 前 诊 断技 术 包括两方面： 取材技 术 、 实验 室 检测 技术一、 产 前 诊 断的基本概念取材技取材技 术术非侵入性 ：超声
4、波 检查母血胎儿 细 胞 检查 母血胎 DNA/RNA检查侵入性：绒 毛取 样 （ 孕 7-9周） 羊膜腔穿刺（孕 16-20周）脐带 穿刺（孕 20-24周 ） 胎儿 镜检查 （孕 18-20周）产前诊断检测技术应用范围一、 产 前 诊 断的基本概念（ 一 ） 应选择 合适的 时 期和方法 进 行染色体相关疾病的 产 前 诊 断二、染色体核型分析孕期 12-26+6w 16w 16-22w 24-28w样本 外周血胎儿 DNA 绒毛 羊水 脐带血方法 NIPT核型或核型 +FISH或核型 +NGS核型或核型 +FISH或核型 +NGS核型或核型 +FISH或核型 +NGS报告时间 10个工作
5、日FISH： 1w核型： 3wNGS： 10个工作日FISH： 1w核型： 3wNGS： 10个工作日FISH： 1w核型： 3wNGS： 10个工作日染色体核型：染色体核型： 46， X， del （ X）（）（ q25） （ 二）典型 案例 分析 A： 女， 36，体格检查未见明显异常二、染色体核型分析染色体核型：染色体核型： 45， XY， rob（ 13； 13），）， -13， -13（ 二） 典型 案例 分析 B： 男， 50，身体健康二、染色体核型分析（ 二） 典型 案例 分析 C： 刘 ， 女 ，表型正常二、染色体核型分析45， XX， rob（ 14； 21）（）（ q10；
6、 q10） ？女方： 28岁 ，孕 3产0，胎停育 2次，染色体核型： 46XX, t（3;5） (q25； p15)男方：核型正常孕 20周，外院影像学排畸没有 发现 异常二、染色体核型分析（三）多种方法平行使用 A3 号和 5号染色体平衡异位患者胎儿 CNV检测 愉快木偶综合征 （快乐天使综合征） 染色体异常 ： 15q11-q13缺失 发病率： 1/40000 临床特征： 小头畸形、严重智力障碍、语言障碍、共济失调步态、好动、 无意识发笑 机制： 母源性 15q11-q13缺失或UBE3A基因突变二、染色体核型分析（三）多种方法交叉 使用 B Angelman综合 征患儿染色体核型未见异
7、常二、染色体核型分析FISH检测结果示： 15q11-q13缺失二、染色体核型分析33岁孕妇，孕 24周， 46， XN， B超提示胎儿多处软指标异常，表现为胎儿颈后软组织增厚，肠管回声增强，单脐动脉，对培养后的羊水细胞进行 了高通量测序染色体异常检测 ，结果显示：存在 1处染色体结构异常： 22q11.21-22q11.23存在 2.3M缺失，该片段包UBE2L3,YDJC,CCDC116等几十个基因或基因片段。 22q11.21-22q11.23区域的片段缺失与 22q11.2缺失综合征（ 22q11.2 deletion syndrome）有关，临床表现为身材矮小，面部异常，智力障碍等。
8、二、染色体核型分析（三）多种方法交叉使用 核型 正常， B超异常的染色体因素深度排查（一） NIPT结果分析？结 果检测项 目阳性 真阳性 假阳性 假阴性 拒 绝 随 访 /失 联21三体 0.199% 0.111% 0.044% 0.022% 0.044%性染色体异常 0.155% 0.044% 0.044% - 0.066%二、 NIPT/CNV1. NIPT的假阳性胎儿染色体核型分型重视知情同意2.NIPT的假阴性重视影像学的检查？结 果检测项 目阳性 真阳性 假阳性 假阴性 拒 绝 随 访 或失 联21三体 0.199% 0.111% 0.044% 0.022% 0.044%（个 别
9、拒绝 随 访 ）性染色体异常 0.155% 0.044% 0.044% - 0.066%二、 NIPT/CNV胎盘嵌合 -假阳 性发生率约 1/1000New England Journal of Medicine， 371;6 577-578（ 2014）胎盘嵌合 -假阴性2117周 NIPT检测结果： 45， XO；羊穿结果 ： 47， XX， +18Molecular Cytogenetics. 2014, 7:48假阴性原因排查过程 原因排查过程取样：母亲血细胞 DNA、胎儿组织、胎盘组织分析方法：测序、 FISH和 CMA母亲核型正常 46， XX （排除母体干扰）NIPT 流 产
10、的胎儿 组织 ： T18 胎 盘组织 ： 45, X (60%) and T18 (嵌合率 30%) FISH 流 产 的胎儿 组织 ： T18 胎 盘组织 ： 45, X cells (67%, 62/92) and T18 cells (30%, 28/92) SNP-array流 产 的胎儿 组织 ： T18 胎 盘组织 ： 45, X cells (67%) and T18 cells (50%) 胎儿为 100%浓度的 47， XX， +18胎盘嵌合，大部分细胞为 45,XO; 少量细胞为 47， XX， +18 母体自身染色体异常干扰样 本 ID 实验编 号 chr13 chr18
11、 chr2118010072 1 -0.426 3.713 -1.256 18010072 2 -0.576 3.229 0.366 18010072 3 -1.109 4.207 -0.676 18010072 4 -1.015 2.816 -0.631 孕妇 年龄 30岁 ，孕 27周 ， NIPT多次上机均提示 T18高风险。 胎儿 B超未发现任何异常，羊穿显示为 46， XY。 后 来 CNV分析显示为 母体 18号染色体短臂微重复所致的假阳性。影响无创产前筛查的因素 母体染色体核型异常： 母体的 实质肿 瘤： 发 生内在基因 组 成改 变 的状况 胎 盘 嵌 合体（ confined
12、 placental mosaicism， CPM） 染色体 单亲 二倍体（ uni-parentaldisomy, UPD） 胎儿嵌合 孪 生儿消失 现 象 胎儿游离 DNA浓 度太低： 实验 室操作 错误 孕周 （ 12W） 妊娠 情况 （ 单 胎 /双胎 /多胎 ?） 既往 病 史如 异体 输 血、移植手 术 、干 细 胞 治 疗 、 免 疫治 疗 、 肿 瘤 、病毒感染等可能引入外源 DNA或改 变 胎 儿 游离 DNA的 组 成和比例，影响 检测结 果 ） 样 本状 态 及运 输溶 血？ 是否 及 时 采用冷 链 运 输知情同意非常重要！分析前质量控制分析中质量控制产 物分析区空气流
13、向空气流向 空气流向 空气流向缓 冲 间 缓 冲间缓 冲间专 用走廊 工作流向扩 增区 标 本制 备 区 试剂 准 备区合理的 实验 室分区严 格的 实验 室 环 境控制 （如温湿度， 稳压 或不 间 断 电 源）仪 器 设备 及管理 （ PCR仪 、离心机、加 样 器等定期 维护 并校准）人 员资质 及培 训产前筛查与产前诊断 （全基因组低拷贝测序技术）缓冲间测序区空气流向 空气流向 空气流向 空气流向缓冲间 缓冲间 缓冲间专用走廊 工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区胎儿 游离 DNA浓 度 测 定方法 多重 SNP法 (4%)Y染色体法文 库 构 建 -DNA片段 筛选尽可
14、能消除母体 基因组 DNA的 背景 干 扰 ，富集游 离 DNA（cfDNA）分析中质控准确的文 库质检 是后 续 获 得高 质 量、 均 一数据的关 键分析中质量控制荧 光定量 标 准曲 线 法文 库浓 度 测 定 ：1.qPCR法 /Qubit对 DNA浓 度准确 定量； 2.Aiglent 2100对文库的质量进行定性2100检测结果分析后质量控制审 核 项 数据要求 异常 处 理原始数据量（ M） 3.5M 重上机Q30(1000个碱基中的 错误 率 ) 85 重上机Unique reads数量（ M） 2M 重上机比 对 率 62.5% 重建 库Duplication率 15% 重建 库样 本 GC含量 EDTA: 38%-42%Ardent: 35%-42%重建 库分析完成后，首先查看原始数据量， Q30， 对照品结果和 GC偏移度是否通过等等 下机样本数据要求
