1、第四章 生物信息的传递（下） 从mRNA到蛋白质,第一节 遗传密码三联子,遗传密码 (genetic code): DNA（或mRNA）中核苷酸序列与蛋白质中氨基酸序列之间的对应关系。 密码子(codon)： mRNA上每3个核苷酸破译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这3个核苷酸就称为三联子密码。,（一）三联子密码及其破译,翻译从起始密码子AUG开始，沿着53方向连续阅读密码子，直至终止密码子为止。 若以3个核苷酸代表一个氨基酸，有43=64种密码子，满足了编码20种氨基酸的需要。,遗传密码破译简史,（1）1954年Gamow首先对遗传密码进行了探讨； （2）1961年Crick 证明三联体密码
2、子是正确的； （3）1961年，Nirenberg以均聚物、随机共聚物、特定序列的共聚物作模板合成多肽，破译遗传密码； （4）1964年Nirenberg 用核糖体结合技术研究遗传密码，直接测出三联体对应的氨基酸； （5）到1966年，遗传密码全部破译。,1.制备E.coli无细胞合成体系，以均聚物、随机共聚物和特定序列的共聚物模板指导多肽的合成。 多聚同一核苷酸的翻译 多聚重复核苷酸的翻译2.核糖体结合技术,遗传密码的破译,核糖体结合技术,保温,硝酸纤维滤膜过滤,分析留在滤膜上的核糖体-AA-tRNA,确定与核糖体结合的AA和模板,特定三核苷酸为模板 + 核糖体 + 20 种AA-tRNA
3、(其中一种AA-tRNA的氨基酸被14C标记）,遗 传 密 码,阅读方向为5-3,（二）遗传密码的性质,1.密码的连续性 2.密码的简并性 3.密码的方向性 4.密码的摆动性 5.密码的普遍性与特殊性,1、密码的连续性,读码无标点、无重叠，阅读方向为53,遗传密码的连续性,从mRNA 5端起始密码子AUG到3端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为开放阅读框架(open reading frame, ORF)。,open reading frame, ORF,移码突变,2、密码的简并性,大多数氨基酸都存在几个密码，由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为
4、密码子的简并性（degeneracy）。密码子碱基数确定和对应性（64个密码子对20种氨基酸） 确定同一个氨基酸的不同密码称为同义密码（synonymous codons）。,密码的简并性可以减少碱基突变造成的有害效应。 在标准遗传密码表中，只有一个密码子的氨基酸是Trp和Met。,遗传密码的简并性,3、密码的方向性,指阅读mRNA模板上的三联体密码时，只能沿53方向进行。,4、密码的摆动性,1966年，Crick提出摆动假说（Wobble hypothesis）,tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子配对时，密码子的第一位、第二位碱基配对是严格的，第三位碱基可以有一定变动，这种现象称为密码
5、的摆动性或变偶性（wobble）。 I（肌苷，次黄嘌呤核苷）A、U、C配对。,在密码子第三位碱基与反密码子第一位碱基之间，碱基配对的摆动允许形成G-U配对。,G-U pairs form at the third codon base,5、密码的普遍性与特殊性,遗传密码无论在体内还是体外，无论是对病毒、细菌、动物还是植物而言都通用。,在真核细胞线粒体中， UGA不是终止密码子，是Trp的密码子； AUA不是Ile的密码子，而是Met的密码子； AGA和AGG不是Arg密码子，而是终止密码子。,第二节 tRNA,mRNA：蛋白质的DNA序列信息的中间体。 tRNA：运送特定氨基酸到核糖体上合成蛋
6、白质。 rRNA：核糖体的组成元件。,概 述,mRNA,原核生物mRNA与真核生物mRNA结构比较,核糖体可以不从mRNA上解离连续合成三个蛋白质,2.1.2 原核生物mRNA与真核生物mRNA生命周期比较,2) The life cycle of Eukaryotic mRNA messenger RNA:expression of mRNA in animal cells requires transcription, modification, processing, nucleocytoplasmic transport, and translation.,Eukaryotic mRN
7、A is modified and exported,一、tRNA的二级结构,二级结构：三叶草型 三级结构：倒L型 稀有核苷含量多,二、tRNA的三级结构,tRNA折叠为紧凑的L型三级结构。,三、tRNA的功能,在蛋白质合成中，起着运载氨基酸的作用，按照mRNA链上的密码子所决定的氨基酸顺序将氨基酸转运到核糖体的特定部位。,3端CCAOH上的氨基酸接受臂 识别氨酰tRNA合成酶的位点 核糖体识别位点 反密码子位点,tRNA特异性只取决于反密码子,与携带的氨基酸无关,四、tRNA的种类,（一）起始tRNA和延伸tRNA,一类特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA
8、为延伸tRNA.,原核起始tRNA携带fMet 真核起始tRNA携带Met,（二）同工tRNA,携带相同氨基酸而反密码子不同的一组tRNA称为同功受体tRNA,原因：tRNA 的数目（20余种）大于氨基酸数目,同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被AA- tRNA合成酶识别.,同工tRNA的特性：,（三）校正tRNA（suppressor tRNA）,错义突变校正 无义突变校正,校正tRNA的类型：,1、无义突变与无义突变校正,在蛋白质的结构基因中,一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子(UAG、UGA、UAA),使蛋白
9、质合成提前终止,合成无功能的或无意义的多肽,这种突变就称为无义突变. tRNA可通过改变反密码子区校正无义突变。,大肠杆菌无义突变的校正tRNA,Nonsense suppressor,错义突变的校正tRNA通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上,合成正常的蛋白质,2、错义突变与错义突变校正,错义突变是由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另外一种氨基酸的密码.,Missense suppression,五、氨酰-tRNA合成酶,氨基酰tRNA合成酶催化的反应：,氨基酸 ATP+E 氨基酰-AMP-E PPi,第一步：活化反应,第二步：转移反应,氨基酰-AMP-E tRNA
10、 氨基酰-tRNA AMPE,Ala-tRNAAla Ser-tRNASer Met-tRNAMet,氨基酰-tRNA的表示方法,真核生物： Met-tRNAiMet 原核生物： fMet-tRNAifMet,第三节 核糖体,一、核糖体的结构,二、rRNA,5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA 5.8S rRNA 5S rRNA 28S rRNA 18S rRNA,原核生物翻译过程中核糖体结构模式,A位：氨基酰位 (aminoacyl site),P位：肽酰位 (peptidyl site),E位：排出位 (exit site),三、核糖体的功能,活性中心： mRNA结合部位 结
11、合或接受AA-tRNA部位 结合或接受肽基tRNA的部位 肽基转移部位 形成肽键的部位（转肽酶的中心） 负责肽链合成的各种因子的结合位点,A,P,功能位点,E,第四节 蛋白质合成的生物学机制,20种氨基酸(AA)作为原料 酶及众多蛋白因子，如IF、eIF ATP、GTP、无机离子,参与蛋白质生物合成的物质包括,三种RNA mRNA（messenger RNA, 信使RNA） rRNA（ribosomal RNA, 核糖体RNA） tRNA（transfer RNA, 转移RNA）,蛋白质生物合成的过程,氨基酸的活化 肽链合成的起始 肽链的延长 肽链合成的终止和释放 新合成多肽链的折叠和加工处理
12、,一、氨基酸的活化,第一步：活化 第二步：转移,氨基酰tRNA合成酶催化的反应：,氨基酸 ATP-E 氨基酰-AMP-E PPi,第一步：活化反应,第二步：转移反应,氨基酰-AMP-E tRNA 氨基酰-tRNA AMPE,tRNA与酶结合的模型,tRNA,氨基酰-tRNA合成酶,ATP,Ala-tRNAAla Ser-tRNASer Met-tRNAMet,氨基酰-tRNA的表示方法,真核生物： Met-tRNAiMet 原核生物： fMet-tRNAifMet,原核生物： fMet-tRNAifMet,Met + tRNA +ATP Met-tRNAfMet +AMP +PPi,四氢叶酸,
13、fMet-tRNAfMet,二、翻译的起始,mRNA和起始氨酰-tRNA分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物.,原核生物翻译起始复合物形成真核生物翻译起始复合体形成,(一)原核生物翻译起始复合物形成,1、翻译起始需要的几种成分：,30S小亚基 模板mRNA fMet-tRNAfMet 三个翻译起始因子（IF-1、IF-2 、 IF-3） GTP 50S大亚基 Mg 2,2、翻译起始包括以下几个步骤：,核糖体大小亚基分离； mRNA在小亚基定位结合； 起始氨酰-tRNA的结合； 核糖体大亚基结合。,1） 核糖体大、小亚基分离,IF-1和IF-3与小亚基结合，促进核糖体大、小亚基拆离，为新一轮合
14、成作准备。,IF-3,IF-1,2) mRNA在小亚基的精确定位结合：,SD sequence,The site for ribosome binding,3） 起始氨酰tRNA( fMet-tRNAfMet )结合到小亚基,起始 fMet-tRNAfMet在IF2-GTP帮助下，进入小亚基P位，并对应模板mRNA的起始密码AUG。,4） 核糖体大亚基结合，起始复合体形成,IF2结合的GTP被水解，三种IF脱离，50S大亚基与30S小亚基、模板mRNA以及起始fMet-tRNAfMet构成起始复合体。,IF-3,IF-1,IF-2,-GTP,-GDP,Pi,(二)真核生物翻译起始复合物形成,真
15、核生物翻译起始复合体的形成过程与原核生物类似，但参与的蛋白因子更多。 核糖体大小亚基分离； 起始氨基酰-tRNA结合； mRNA在核糖体小亚基就位； 核糖体大亚基结合。,Poly A结合蛋白,帽子结合蛋白,真核生物翻译起始复合体形成过程,原核和真核生物中各种起始因子的生物功能,延长阶段由一循环反应过程来完成，每次循环增加一个氨基酸残基。 在翻译起始复合体形成的基础上，活化氨基酸在核糖体上反复翻译mRNA上的密码并缩合生成多肽链的循环反应过程，称为核糖体循环。 核糖体循环包括多肽链合成的进位、转肽、脱落和移位三步反应。,三、肽链的延长,1. 进位,即与mRNA下一个密码相对应的氨基酰tRNA进入
16、核糖体的A位。此步骤需GTP，Mg2+，和EF-T参与。,2. 转肽,是由肽基转移酶(peptidyl transferase)催化的肽键形成过程。 在肽基转移酶的催化下，将给位上的tRNA所携带的fMet基或肽酰基转移到受位上的氨基酰tRNA上，与其-氨基缩合形成肽键。,转肽反应过程,3. 移位,延长因子EF-G有转位酶( translocase )活性，可结合并水解1分子GTP，促进核糖体向mRNA的3侧移动相当于一个密码的距离，同时使肽酰基tRNA从A位移到P位。此步骤需GTP和Mg2+参与。,移位反应过程,核糖体循环的反应过程,多肽链合成的延长因子,四 、肽链合成的终止和释放,核糖体沿
17、mRNA链滑动，不断使多肽链延长，直到终止信号进入A位。,识别：RF（释放因子）识别终止密码，进入核糖体的A位 水解：RF使转肽酶变为酯酶，多肽链与tRNA之间的酯键被水解，多肽链释放 脱离：模板mRNA、RF以及空载tRNA与核糖体脱离,多肽链合成的终止过程,GTP,RF,原核生物释放因子：RF-1，RF-2，RF-3 真核生物释放因子：eRF,RF的生物学功能主要有： 识别终止密码，如RF-1特异识别UAA、UAG；而RF-2可识别UAA、UGA。 诱导转肽酶改变为酯酶活性，酯键被水解，相当于催化肽酰基转移到水分子-OH上，使肽链从核蛋白体上释放。,多聚核糖体(polysome),使蛋白质
18、合成高速、高效进行。,由若干核蛋白体结合在一条mRNA上同时进行多肽链的翻译所形成的念球状结构称为多聚核蛋白体（polysome）。,多聚核糖体,电镜下的多聚核蛋白体现象,五、蛋白质前体的加工,(一)一级结构的加工修饰,1、N端fMet或Met的切除,脱甲酰基酶或氨基肽酶, 去甲酰化：, 去蛋氨酰基：,2、二硫键的形成,两个Cys的氧化形成二硫键,-,OOC,-,CH,-,CH,2,-,S,+,NH,3,S,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,+,NH,3,-,OOC,-,CH,-,CH,2,-,S,+,NH,3,S,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,+,NH,3, 半胱氨酸,胱氨酸
19、,HS,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,+,NH,3,HS,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,+,NH,3,3、特定氨基酸的修饰,羟脯氨酸,羟赖氨酸的羟化; 含-OH的丝氨酸,苏氨酸,酪氨酸的磷酸化; 组蛋白的乙基或甲基化,蛋白质侧链的修饰作用包括：磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化和羧基化等.,磷酸化 由多种蛋白激酶催化,糖基化 糖基一般连接在4种氨基酸上，分为2种： O连接的糖基化 与Ser、Thr和Hyp的-OH连接，连接的糖类为半乳糖或N-乙酰半乳糖. 在高尔基体上进行O连接的糖基化. N连接的糖基化 与Asn的NH2连接 在内质网上进行的为N-连接的糖基化 甲基化
20、由N-甲基转移酶催化,4、切除新生肽链中非功能片断,由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除。 酶原激活（前体功能蛋白质）多肽类激素和酶的前体要经过加工才能变为活性分子。如胰蛋白酶原，前胰岛素原，血纤维蛋白原等，还有蜂毒素。,胰岛素蛋白的翻译成熟过程,(二)高级结构的修饰,1、亚基的聚合,具有四级结构的蛋白质由两条以上的多肽链通过非共价键聚合形成寡聚体。,2、辅基的连接,结合蛋白合成后需要结合相应的辅基才能成为具有天然活性的蛋白质。,（三）新生肽链的折叠,新生肽链必须通过正确的折叠才能形成动力学和热力学稳定的三维结构，从而表现出生物学活性或功能。 一般认为，多肽链自身氨基酸顺序储存着蛋白质折叠的信
21、息，即一级结构是空间构象的基础。 细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶、蛋白辅助。,分子伴侣（molecular chaperone）能够在细胞内辅助新生肽链正确折叠的蛋白质。是一类序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质。按是否自发性折叠分为：热休克蛋白和伴侣素。,六、蛋白质合成抑制剂,抗生素,干扰素,(一)抗生素,嘌呤霉素作用示意图,(二)干扰蛋白质生物合成的生物活性物质,白喉毒素 对真核生物剧毒可对EF-2起共价修饰作用干扰素(interferon，IF)是细胞感染病毒后产生的一类蛋白质.可抑制病毒繁殖,保护宿主. 能诱导特异的蛋白激酶，使真核生物起始因子eIF2磷酸
22、化失活，抑制病毒蛋白质合成。,第五节 蛋白质运转机制,1、翻译-运转同步机制 2、翻译后运转机制 (1)线粒体蛋白质跨膜运转 (2)叶绿体蛋白质的跨膜运转 3、核定位蛋白的运转机制 4、蛋白质的降解,过氧化物酶体,蛋白质的合成位点与功能位点常常被细胞内的膜所隔开，蛋白质需要运转。 核糖体是真核生物细胞内合成蛋白质的场所，任何时候都有许多蛋白质被输送到细胞质、细胞核、线粒体和内质网等各个部分，补充和更新细胞功能。 细胞各部分都有特定的蛋白质组分，蛋白质必须准确无误地定向运送才能保证生命活动的正常进行。,细胞中蛋白质的合成：绝大多数在细胞质中合成；一小部分在细胞器（叶绿体和线粒体）中合成。定位于细
23、胞器内的大部分蛋白质在细胞质中合成，细胞器内合成的留在细胞器内。蛋白质插入或穿过生物膜的过程称为蛋白质运转（protein translocation）。,蛋白质运转的两种方式,翻译-运转同步 （co-translational translocation）是即将进入内质网的蛋白质的易位方式；蛋白质正合成的时候就可与运转装置结合； 蛋白质合成时，核糖体定位于内质网表面，称膜结合核糖体(membrane-bound ribosome）。分泌蛋白质大多是以同步机制运输的,蛋白质翻译完成后从核糖体上释放，然后扩散至合适的靶膜并与运转装置结合。 蛋白质合成时，其核糖体不与任何细胞器相连，称游离核糖体(
24、free ribosome) 在细胞器发育过程中，由细胞质进入细胞器的蛋白质大多是以翻译后运转机制运输的。 参与生物膜形成的蛋白质，依赖于上述两种不同的运转机制镶入膜内。,翻译后运转 （post-translational translocation）,溶酶体,分泌小泡,质膜,一、翻译-运转同步机制,真核细胞分泌蛋白等前体合成后靶向输送过程首先要进入内质网。,信号肽(signal peptide),各种新生分泌蛋白的N端有保守的氨基酸序列称信号肽。,信号序列特点：,（1）一般带有10-15个疏水氨基酸； （2）在靠近该序列N-端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸； （3）在其C-末端靠近蛋白酶切
25、割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（丙氨酸或甘氨酸）。,靶向输送蛋白的信号序列或成分,信号肽的一级结构,信号肽假说内容： （1）蛋白质合成起始首先合成信号肽 （2）SRP（信号识别蛋白）与信号肽结合，翻译暂停 （3）SRP与SRP受体结合，核糖体与膜结合，翻译重新开始 （4）信号肽进入膜结构 （5）蛋白质过膜，信号肽被切除，翻译继续进行 （6）蛋白质完全过膜，核糖体解离,蛋白质合成起始首先合成信号肽,信号肽与蛋白质转运的关系,（1）完整信号肽是保证蛋白质转运的必要条件； （2）仅有信号肽不足以保证蛋白质转运发生； （3）信号序列切除并不是转运所必需；
26、（4）并非所有运转蛋白质都有可降解的信号肽。,新生蛋白质通过同步转运途径进入内质网内腔的主要过程,二、翻译后运转机制,叶绿体和线粒体中有许多蛋白质和酶是由细胞质提供的，其中绝大多数以翻译后运转机制进入细胞器内。,前导肽及其特性: 翻译后跨膜易位的蛋白质，前体一般含前导肽(leader peptide)，前导肽在跨膜运转中起重要作用。 过膜后，前导肽水解，蛋白质变为有功能的蛋白质。,P146,（一）线粒体蛋白质跨膜运转,（二）叶绿体蛋白质跨膜运转,（3）核定位蛋白的运转机制,蛋白质一般通过核孔进入细胞核。 核糖体蛋白首先在细胞质中合成，运转到细胞核内，在核仁中被装配成40S和60S核糖体亚基，然
27、后运转回到细胞质中去合成蛋白质。RNA、DNA聚合酶、组蛋白、拓扑异构酶及大量转录、复制调控因子都必须从细胞质进入细胞核才能正常发挥功能。,（四）蛋白质的降解,概 述,生物体内蛋白质的降解过程是一个有序的过程。当细胞中出现错误的蛋白质或半衰期很短的蛋白质时，蛋白酶被激活。 蛋白质的半衰期大约从30s到许多天不等。像血红蛋白这样少数蛋白的半衰期与细胞周期同样长(成红细胞110天)。 蛋白质半衰期与成熟蛋白N端的第一个氨基酸(除已被切除的N端甲硫氨酸之外)有很大关系当某个蛋白质的N端是甲硫氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸时，表现稳定。其N端为赖氨酸、精氨酸时，表现最不稳定，平均2-3m
28、in就被降解了。,蛋白质的降解依赖于泛素（ubiquitin，Ub）。 泛素由个高度保守的氨基酸组成，普遍存在于真核生物中，故名泛素。它最初是从小牛的胰脏中分离出来的。 共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。 泛素相当于蛋白质被摧毁的标签，被贴上标签的蛋白质就会被运送到细胞内的“垃圾处理厂”，在那里被降解。,降解涉及到的三种重要酶,泛素活化酶(u2 biquitin - activating enzyme，E1) 泛素结合酶（ubiquitin - conjugating e
29、nzyme，E2) 泛素蛋白连接酶(ubiquitin -proteinligating enzyme, E3)E1,E2,E3的作用：E1激活泛素分子，E2就负责把泛素分子绑在被降解蛋白质上。E3能识别被降解的蛋白质。,有序降解的过程： 生物细胞内即将被降解的蛋白首先在ATP的作用下 与泛素相连，这个过程需要E1,E2,E3三个降解因子参与。 在蛋白质的泛素化过程中，E1水解ATP获取能量，通过其活性位置的半胱氨酸残基与泛素的羧基末端形成高能硫酯键而激活泛素，然后E1将泛素交给E2，但E2并不认识指定的蛋白质，这就需要E3帮助。E3具有辨认指定蛋白质的功能。当E2携带着泛素分子在E3的指引下接近指定蛋白质时，E2就把泛素分子绑在指定蛋白质上。 这一过程不断重复，指定蛋白质上就被绑了一批泛素分子。被绑的泛素分子达到一定数量后，指定蛋白质就被运送到细胞内的一种称为蛋白酶体的结构中。此时共价结合泛素的蛋白质就被蛋白酶体识别和降解，切成由至个氨基酸组成的短链 。,课后作业,试论蛋白质生物合成在原核和真核生物中的区别？,
