1、第四节、培养基,培养基（Culture medium)为适应于特定微生物生长、繁殖或产生代谢产物而配制的营养混合物。,任何培养基都必须含有微生物生长所必需的六大营养要素碳源、氮源、能源、水、无机盐和生长因子。且各种成分之间的比例应与微生物生长繁殖相适应。,一、选用和设计培养基的原则和方法,（一）选用原则：,1、目的明确设计培养基之前，必须先明确要培养何 种微生物、其次微了解生物的生长特性以及培养此类微生物的用途。,2、营养协调指的是根据微生物细胞中的各种成分的含量及为生物的生长特性，协调六大营养要素之间的比例。在多数化能异养微生物配制培养基中，除水分外，碳源（兼能源）的含量最高，其次依次是氮源
2、、大量元素和生长因子。,即：H2OC+能源N源P、SK、Mg生长因子,碳氮比（C/N） 定义：指碳源与氮源含量之比。严格说，C/N比是指在微生物培养基中所含有的碳源中碳原子摩尔数与氮源中氮原子摩尔数之比。一般而言，真菌培养基需C/N比含量高，细菌尤其是动物病原菌培养基需C/N比较低。,C/N比的意义：对于培养基，营养的协调特别是碳源与氮源之比（C/N)非常重要，C/N直接控制着菌体的生长情况和代谢产物的产出。例如在谷氨酸合成工业中当C/N=4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸合成受到抑制；当C/N=3/1时，菌体生长受到抑制，而谷氨酸却能大量合成。,3、理化适宜指的是培养基的PH、渗透压、水分活度、
3、氧化还原势四种条件的适宜。,（1） PH 每一类生物都有自己生长繁殖所能承受的PH生态幅，例如：细菌为7.08.0，放线菌为7.5 8.5，酵母菌为3.8 6.0，霉菌为4.0 5.8，藻类为6.0 7.0，原生动物为6.0 8.0。当PH接近或达到生态幅极限时，就会限制这类生物的生长繁殖。说明：在微生物生长繁殖过程中， 其代谢产物会引起培养基PH的改变， 因此要进行必要的调节。,PH的调节作用：内源调节,内源调节,借助磷酸缓冲液进行调节（等摩尔浓度比时，PH可稳定在6.8左右）,以CaCO3作“备用碱”进行调节（有时可用NaHCO3代替）,K2HPO4+HCLKH2PO4+KCL KH2PO
4、4+KOHK2HPO4+H2O,在设计培养基时就在培养基内加入一定的缓冲备用物，通过这些培养基成分对PH的调节称为内源调节。外源调节:直接在培养基内加入酸或碱进行调节。,CO32-HCO3-H2CO3CO2+H20,（2）渗透压和水分活度, 渗透压：指半透膜两侧的两种不透离子浓度的溶液中水分子穿透膜达到平衡时的机械压力，与离子浓度成负相关。,渗透压的大小由溶液中的所含有的分子数或离子的质点数所决定。等重的物质，其分子或离子越小，则质点数越多，产生的渗透压越大。, 水分活度(aw)：表示组织中的自由水和游离水的含量比的指标，定义为：同温同压下，某溶液的蒸气压(P)与纯水蒸气压(P0)之比。aw=
5、 P/ P0=ERH/100说明：每种微生物都有一个生理上的渗透压和水分活度的耐受幅。各种微生物生长繁殖范围的aw值在0.998 0.60之间。,（3）氧化还原势,定义：又称氧化还原电位，是度量氧化还原系统还原剂释放电子或氧化剂接受电子的一中指标。氧化还原势一般以Eh表示，指以氢电极为标准时氧化还原系统的电极电位值，单位是V和mV。一般而言，好氧菌的Eh为+0.30.4V；兼性厌氧菌的Eh为+0.1V以下进行有氧呼吸，否则发酵产能；厌氧菌只能在+0.1V 以下的环境中。,4、经济节约,所谓经济节约就是指以最低的成本获得最大的产出。,经济节约的原则：,（1）以粗代精 （2）以“野”代“家”：如用
6、木薯粉代替优质淀粉； （3）以废代好：如造纸厂的亚硫酸废液可以培养酵母菌；豆制品厂的黄浆水可以培养白地霉菌。 （4）以简代繁：越作改进，即可以在 使微生物能正常生长繁殖的前提下， 适当减去一些培养基成分， 降低成本。,（5）以氮代朊：尽量利用微生物的自身合成能力，以硝酸盐的无机氮素代替氨基酸和蛋白质； （6）以纤代糖：用纤维素代替糖类； （7） 以烃代粮：例如用单细胞蛋白代替蛋白质、氨基酸及能源物质； （8）以“国”代“进”：例如以棉子粉代替玉米粉、以白玉米粉代替乳糖的培养基，推动了中国的青霉素发酵工业的快速发展。,（二）设计培养基的四种方法,1、生态模拟2、参阅文献3、精心设计4、实验比较,
7、二、培养基分类,按培养基成分分类,天然培养基,组合培养基,按培养基外观的物理状态分类,液体培养基,固体培养基,半组合培养基,半固体培养基,脱水培养基,固化培养基,非可逆固化培养基,天然固态培养基,滤膜,按培养基对微生物的功能分类,选择性培养基,鉴别性培养基,1、天然培养基 定义：指利用动植物或微生物包括用其提取物制成的培养基，成分复杂，营养丰富，适用于实验室、发酵工业中的培养菌种。如牛肉膏蛋白胨培养基（细菌）、麦芽汁培养基（酵母菌）。,天然培养基的优点：营养丰富、种类多样、配制方便、价格低廉。 天然培养基的缺点：成分不明确，不稳定。说明：在配制天然培养基时，常 使用天然材料包括酪蛋白、 大豆蛋
8、白酵母粉、蛋白胨等。,2、组合培养基 定义：是一类按微生物营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制而成的培养基。例如：培养E.coli等细菌用的葡萄糖胺盐培养基；培养霉菌用的淀粉硝酸盐培养基；培养真菌用的蔗糖硝酸盐培养基。,组合培养基的特点： （1）成分明确、重演性高； （2）价格昂贵、配制麻烦，且微生物生长很一般。 （3）组合培养基仅适用于营养、代谢、 生理、生化、遗传、育种、鉴定 或生物测定等对定量要求 较高的研究领域。,3、半组合培养基 定义：指一类以化学试剂为主同时加入了一些天然成分的培养基，又称半合成培养基。如马铃薯蔗糖培养基（真菌）。,1、液体培养基：广泛用于实验室和生产实践中，尤
9、其适用于大规模的培养微生物。,2、固体培养基：包括固化培养基、非可逆固化培养基、天然固态培养基、滤膜四种类型。,（1）固化培养基：常称“固体培养基”，由液体培养基加入琼脂或明胶等凝固剂制成。例如：LB培养基（大肠杆菌） 特点：遇热可融化，冷却后则呈凝固态。,固体培养基应用：在科学研究领域和生产实践中用途很广，可用于分离鉴定、菌落计数、检验杂菌，选种育种、菌种保藏、生物活性物质的生物测定、获取大量真菌孢子，以及微生物的固体培养和大规模生产。,（2）非可逆固化培养基：在液体培养基中加如硅胶等，凝固后不再融化。例如：血清培养基、无机硅胶培养基,（3）天然固态培养基：由天然固态基质直接配制成的培养基。
10、,（4）滤膜：将滤膜浸入液体培养基后取出，可以用于对含菌量较少的水中微生物进行过滤、浓缩，最终可计算含菌量。,3、半固体培养基 定义：在液体培养中加入少量凝固剂（如加入0.5%稀琼脂）而制成的半固体状态的培养基。例如：稀琼脂,应用：半固体培养基可在试管内形成“直立柱”，可用于细菌的动力观察，趋化性研究，厌氧菌的培养、分离计数，以及细菌及酵母菌种的保藏，在平板上，可以测定噬菌体的效价。,又称为脱水商品培养基或预制干燥培养基，指除含水分以外的一切成分的商品培养基。在使用前，需先加入适量水分并加以灭菌。,优点：成分精确、适用方便,4.脱水培养基,1.选择培养基（selected medium),定义
11、：指根据特定微生物的营养要求或其对某种化学、物理因素的抗性而设计的培养基。 特点：具有使混合菌群中的劣势种群变为优势种群的功能，用于菌群的筛选。,选择培养基的配制策略（原理）：投其所好或 取其所抗。即可根据所需获得的菌群的特性 而制成相应加富型选择培养基 或抑制性选择培养基。,2、鉴别培养基（different medium),定义：指在设计培养基时在其中加入能与目的菌长生的无色代谢物发生显色反应的指示剂，从而达到只需通过肉眼辨别颜色就能从混合菌落中找出目的菌落的培养基。,最常使用的鉴别培养基：伊红美蓝培养基（Eosin Methylene Blue EMB),EMB培养基：具有伊红和美蓝的两
12、种可抑制G+细菌和一些难养的G-细菌的苯胺染料的培养基。在低酸度条件下，伊红和美蓝会结合生成沉淀，起着产酸指示剂的作用。例如：大肠杆菌 呈深紫色。,EMB培养基,EMB培养基的成份：蛋白胨（10g）、乳糖（5g）、蔗糖（5g）、K2HPO4（2g）、伊红Y（0.4）、美兰（0.065g）、蒸馏水（1000g）、最终PH（7.2）,鉴别原理：G菌落能分解乳酸而长生大量的混合酸，菌体表面带上H+，可与伊红侵染，伊红又可与美蓝结合，使菌落染上深紫色，而且从反射光中可以看到绿色金属闪光。相对产酸力弱的菌落可呈棕色。,试样,G+细菌：受抑制,G菌落,能发酵乳酸，产酸,不发酵乳酸，不产酸，菌落无色透明,产酸力强，菌落在透射光下呈紫色，反射光下呈绿色金属闪光,产酸力弱，菌落棕色,意义：（1）可以鉴别不同的菌落；（2）抑制抑制G+细菌和促进G-肠道菌生长；（3）检测饮用水是否被污染、 牛奶等饮料是否已变质。,
