1、分子生物学实验理论与操作教程分子生物学实验理论与操作教程中国农科院研究生院中国生化及分子生物学学会植物病虫害生物学国家重点实验室二零零四年七月目 录前 言-I第一部分 核酸提取-1实验一：基因组 DNA 提取-1实验二：总 RNA 提取-3第二部分 亚克隆技术-8实验三：质粒 DNA 提取-8实验四：DNA 片段的酶切-9实验五：DNA 片段的酶修饰-脱磷-12实验六：DNA 片段的连接-13实验七： DNA 片段的回收-15第三部分 PCR 技术-18实验八：PCR 产物的克隆技术-18八1：T- 载体构建 -19八2：PCR 产物的 T-载 体克隆-20八3：PCR 产物的平端克隆技术-2
2、1 实验九：RT-PCR 技术-21实验十：定量 PCR -25第四部分 文库构建技术-29实验十一：mRNA 的提取及纯化 -29实验十二：cDNA 文库构建技术- cDNA 链的反转合成-32 实验十三：1,cDNA 文 库构建技术- cDNA 链的连接、包装及转染-34实验十三：2,RACE 技术-36第五部分 核酸杂交技术-40实验十四：DNA 探针的标记-40实验十五：Southern 杂交技术-44第六部分：基因及基因产物检测技术-48实验十六：DNA 的测序技术-48实验十七：基因表达 1，基因的体外快速翻译-532，基因的诱导表达-54实验十八：报告基因的应用-57实验十九：W
3、estern 杂交技术-58第七部分 基因表达轮廓技术-67实验二十：DD-PCR 技术-73实验二一：SSH 技术-74第八部分：遗传转化技术-75实验二二：感受态细胞制备-75实验二三：重组基因的转化及筛选-77实验二四：原生质体分离-78实验二五：农杆菌转化技术-79第九部分：分子标记技术-80实验二六：RFLP 技术-86实验二七：RAPD 技术-86实验二八：AFLP 技术-87实验二九：SSR 技术-89第十部分：细胞技术-89实验三十：细胞凋亡-89十一：附录 一-92二-96第一部分 核酸提取目的基因主要可以通过以下途径加以分离获取。对于序列已知或部分已知的寡聚核苷酸基因片断或
4、基因可通过 DNA 的人工合成直接获取；或利用PCR、RT- PCR 及 RACE 技术，直接扩增出相应的基因片段；对于未知序列的基因或基因片断利用 dd-PCR 等差异显示技术、 转坐子标签技术、分子标记技术、图位克隆及电子杂交等手段分离出相应目的基因或探针片段，建立基因组文库或 CDNA 文库，再用探针 从相应文库中钓相关基因。本部分主要介绍基因组DNA 的提取纯化，RNA 提取 纯化等实验方法，其余内容见相应章节。实验 一 :基因 组 DNA 的提取DNA 是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此 DNA 的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本
5、的操作，如不能有效的完成 DNA 提取方面的工作，那就根本 谈不上进行分子生物学方面的实验。在 DNA 提取 过程中应做到 1,根据不同研究需要，保证结构的相应完整性；2,尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及 RNA 等)；3,保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。下面结合不同的研究对象列出几种相应的 DNA 提取方法。方法 1 ，基因 组总 DNA 的大量提取本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在 RNA 酶作用下，降解 RNA，得 纯度较高的 DNA 样品。一： 仪 器 高速冷冻离心机、台式离心机、
6、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪二： 试剂 细胞裂解液（100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl 1% SDS pH 7.5）；饱和酚；氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及无水乙醇；3M NaAC（pH5.2）；RNA 酶；TAE 缓冲液；载样缓冲液三 :操作 动植物材料 10g(鲜组织) 0.5g(干冻组织)液氮,研碎10ml 裂解液(含 1/10 体积酚),(65 预热), 加入等体积氯仿, 65放置 30 分钟，间隔 510min 轻摇一次, 离心(12000-15000rpm, 15min )上清液静止下0.6 体积
7、冷异丙醇,0.1 体积 3MpH5,2 乙酸钠, 挑取絮状体, 70%冷乙醇洗涤,真空干燥,2mlTE(或水)10ulRNase， 65,10-30 分复溶和除 RNA等体积酚/ 氯仿,氯仿抽提（轻轻 混匀、冰浴沉淀 5min，5000RPM 离心 5min，取上清）上清液2V 无水乙醇、1/10VnaAC,-20,2 或 -80，30min10000RPM,10min沉 淀 70%冷乙醇洗涤真空干燥干粉-20 保存，或复溶于 0.5-1mlTE 或水中,分装成小体积, -20或 4保存四： 鉴 定 所提 DNA 进行 Agarose 胶分析（电泳过程见附），紫外观测仪观测，凝胶成像系统拍摄。
8、注意 :1,裂解液要预热,以抑制 DNase,加速蛋白变性,促进 DNA 溶解2，酚一定要碱平衡3,各操作步骤要轻柔,尽量减少 DNA 的人为降解4,取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰.5,异丙醇,乙醇.NaAC,KAC 等要预冷,以减少 DNA 的降解,促进 DNA 与蛋白等的分相及 DNA 沉淀。6,本方法适用于以 DNA 片段的酶切分析、 Southern 印迹等中，具有快速、省时、省线的特点。7,此方法也适合菌类基因组 DNA 的大量提取.方法二： 细 菌基因 组 DNA 的微量提取法本方法通过 SDS 裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB 去除多糖成分一： 仪 器： 同方法一
9、二： 试剂 ： TE、TAE 缓冲液；10%SDS；NaCL；20mg/ml 蛋白酶； CTAB/NaCL 溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于 80ml 水中，缓慢加入 10gCTAB，加热溶解)；25/24/1,酚/氯仿/ 异戊醇; 24/1,氯仿/ 异戊醇；异丙醇；及 100%乙醇三：操作 1.5ml 对数生长期细菌细胞离心，5000rpm,1min沉淀溶于 500l TE 缓冲液中混匀30l 10%SDS,3L蛋白酶，混匀，37 ,1 小时100l NaCL(5M) 混匀80l的 CTAB/NaCL,* 混匀；65 10min（可不做）加入等体积酚/氯仿/
10、异戊醇混合液，混匀，离心 12000rpm,4-5min取上清，以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除 RNA 、复溶等步骤一致。注意 ，* 此步操作后，离心管中 NaCL 的浓 度不应低于 0.5M，否则DNA 将与 CTAB 共沉淀。2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取 DNA。对于菌体样品,通过此流程, 可以获得较为完整的 DNA 分子。方法三：酵母菌基因 组 DNA 的提取一： 仪 器： 同方法一 二： 试剂 ： SE 缓冲液（1M 山梨醇，0.1MEDTA pH7.5）；溶菌酶（50mg/ml）；20PVP；蛋白酶 K 缓冲液（10mM Tris pH7.6 0.5% SD
11、S 1mM EDTA）；其余同前三：操作 1.5ml 对数生长期细菌细胞离心，12000rpm,1-2min沉淀溶于 590ulSE 缓冲液中混匀+10ul 溶菌酶 37,1hr离心，12000rpm,8-10min沉淀溶于 100L，0.5l蛋白酶，混匀， 37,1hr加入 1.2ml 的 CTAB/NaCL,200l20%PVP 混匀 65,30min等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀,离心,12000rpm,4-5min上清,以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除 RNA 、复溶等步骤一致。实验 二： 总 RNA 的提取完整 RNA 的提取和纯化,是进行 RNA 方面的研究工作,
12、如 Nothern 杂交、mRNA 分离、RT-PCR、定量 PCR、cDNA 合成及体外翻译等的前提。所有的提取过程中都有五个关键点，即）：样品细胞或组织的有效破碎；），有效地使核蛋白复合体变性；），对内源酶的有效抑制；）有效地将从和蛋白混合物中分离；5），对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制酶活性。RNA 的提取目前阶段主要可采用两种途径，1),提取总核酸，再用 氯化锂将 RNA 沉淀出来； 2),直接在酸性条件下抽提，酸性下 DNA 与蛋白质进入有机相而 RNA 留在水相。第一种提取方法将 导致小分子量 RNA 的丢失，目前该方法的使用频率已很低。方法一
13、:总 RNA 的 试剂 盒快速提取一些公司推出的总 RNA 提取试剂盒,可以用来制备高质量的可用于建库的RNA。该总 RNA 纯化系统 采用两种著名的 RNA 酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和 -巯 基乙醇 ,加上整个操作都在冰浴下 进行,这样就能显著降低 RNA 的降解速率。GTC 和 N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离 ,使RNA 与蛋白质分离,并将 RNA 释放到溶液中。而 进一步从复合体中纯化 RNA,则根据 Chomc zynski 和 Sacchi 的一步快速抽提法 进行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低 pH 值的酚将使 RNA 进入水相,这样使其与仍留在有机
14、相中的蛋白质和 DNA 分离。水相中的 RNA 可用异丙醇沉淀浓缩 。进一步将上述 RNA 沉淀复溶于 GTC 溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而 RNA 中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。一： 仪 器恒温水浴,冷冻高速离心机,紫外分光光度计,取液器,电泳仪,电泳槽二： 试剂RNA 提取试剂盒,0.05%焦碳酸二乙酯(DEPC),75%乙醇操作步骤 (一):细胞或组织 破碎A: 微生物材料：发酵天 (或对数生 长期)的菌体，离心收集菌丝体(动植物材料无需此步处理)：用经 DEPC 处理的水洗菌丝体次，并尽量除去残存
15、的水：加液氮充分研磨，使其成为粉末，以 释放 RNA：研磨后的样品转移至 ml 变性液的容器中匀 浆。B: 动 植物 细 胞培养材料 (适用的样品量为细胞:108)1:细胞或组织培养:按常规方法进行2:深层悬浮培养细胞的破碎:(1)细胞收集 :含一定浓 度的细胞培养液置于无菌离心管中,4 ,3000g 离心5分钟(2)细胞洗 涤:上步沉淀用 25 毫升灭菌后冰冻的 1PBS 缓冲液洗涤,然后 4,3000g 离心 5 分钟,(3)细胞破碎 :在沉淀细 胞中加入 15 毫升预冷的变性液,用无菌处理过的匀浆器匀浆3:表面培养细胞的破碎:(1)确定培养瓶数量 ,使选定的各培养瓶细胞累加后总量达 10
16、8(2)细胞收集 :将培养液倒掉 ,用预冷的无菌 PBS 缓冲液洗涤一次,在培养瓶中加入 8 毫升预冷变性液,转动培养瓶,使细胞溶解,此时可见粘度加大. (3)用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶,旋转,溶解细胞,再吸入第三个培养瓶,以此类推,直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次,然后从第一个培养瓶开始再加入 4 毫升上述变性液,将所有培养瓶洗一次.(4)将上述 12 毫升含细胞的变性液转移至一 50 毫升无菌离心管中,匀浆破碎细胞.C: 植物 组织 破碎 (适用的样品量为 0.05g 组织)(1)将 600ul 变性液置于 1.5ml 离心管中,将此离心管放于冰浴中 5 分钟.(2)
17、将 0.05g 新鲜组织用液氮冰冻(3)在液氮下 ,研磨组织块(4)待液氮 挥发后,将上述分散的组织转移至无菌离心管中.D: 动 物 组织 破碎 (适用的样品量为 1 克组织)(1)将 12 毫升 变性液置于 50 毫升离心管中,将此离心管放于冰浴中 5 分钟.(2)在上述管中加入 1 克新鲜或冰冻动物组织,匀浆粉碎.注 1:研磨组织块用于 RNA 提取的样品,必须是新鲜 的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70的冰箱中保存。2:变性液及相应的离心管需预冷(二 ):RNA 的抽提在经变性液匀浆的细胞或组织 600ul60ulpH4.0 的 2M 乙酸钠彻底混匀，可
18、用漩涡振荡器600ul 酚氯仿异戊醇(25241),彻底混匀或漩涡振荡器振荡 10 秒冰裕中 10-15 分钟, 离心,4，10000g,20 分钟上层水相吸至无菌离心管中+等体积的异丙醇,-70,30 分钟沉淀 RNA离心 4，10000g,20 分钟沉淀 RNA,冷冻干燥 15 分钟 , RNA 沉淀重新溶于 300ul 变性液中,可振荡(有 时为了帮助溶解，可在 65加热，但时间应极短)60ulpH4.0 的 2M 乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器600ul 酚氯仿异戊醇(25241),彻底混匀或漩涡振荡器振荡 10 秒冰裕中 10-15 分钟, 离心,4，10000g,20 分钟上层水相
19、吸至无菌离心管中等体积异丙醇二次沉淀(-70 ,30 分钟),乙醇洗沉淀,沉淀冷冻干燥,复溶于去 RNA 酶的水中(对于准备长期保存的 RNA 可加入 pH 5.0 的乙酸钠至终浓度为 0.25M，再加入 2.5 体积的乙醇，保存。)注：1 变性液组成：25g 异硫氰酸胍溶于 33mlCSB(42mM pH4.0 乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2mM-巯基乙醇)，65溶解，过滤灭菌， 4预冷。2 酸性酚配制：55时，500g 酚溶入 500ml50mM,pH4.0 乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加 500ml50mM,pH4.0 乙酸钠,直到 pH30min;20过夜将有助
20、于增加核酸的沉淀量。9：在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于 TE 缓冲液中，因溶于 TE 的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。10：核酸提取后可通过 PCR 、RTPCR 直接扩增出目的基因片断，也可首先构建文库、然后由 RACE、dd-PCR 等差异显示技术、AFLP 等标记技术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针，再用此探针从文库中筛选出完整基因。有关这些内容在下面各篇幅中会详细介绍。第二部分：基因克隆技 术目的基因的克隆是分子生物学实验中的
21、核心内容，起着承上启下的作用，通过克隆技术可实现目的基因的无限扩繁、长期保存的目的；利用该技术能实现基因重组、基因改造、构建工程菌和转基因动植物。基因克隆技术主要包括载体的获取、 酶切、脱磷、连接和转化及筛选、 鉴定等内容。本部分将介绍除基因鉴定外的其他内容。实验 三： 质 粒 DNA 的提取和 纯 化整合外源 DNA 并将其带入宿主细胞的过程是分子克隆的关键。而在此 过程中携带外源基因的工具为载体。载体有 1）在宿主细胞中具独立复制能力；2)带抗性等选择标记；3)有合适的限制性内切酶位点，可插入一定片断长度的外源 DNA 而不影响自身复制的特点。目前经基因操作已构建了一大批适合不同宿主细胞，
22、有不同选择标记 的克窿载体或表达载体。这些载体有以下几类：1)宿主为大肠杆菌的细菌质粒、 Lamda 噬菌体、噬菌粒、噬菌体 M13、拈粒和卡粒等；2)宿主菌 为酵母的以酵母人工染色体克隆系统（YAC）为代表的酵母菌质粒载体及酵母菌与大肠杆菌穿梭质粒载体；3)以枯草杆菌为载体的枯草杆菌质粒载体和芽雹杆菌与大肠杆菌的穿梭质粒载体；4)宿主为植物细胞的 Ti 质粒、植物病毒及带有真核启动子的改造质粒；5)动物细胞为宿主的动物病毒和以动物病毒为基础改造的穿梭质粒。在上述所有载体中通用型大肠杆菌质粒载体因具有通用引物序列、多克隆位点区具极多的内切酶特异序列、许多具 互补性质等特点而成为最基本的通用克隆
23、载体。在克隆操作中往往都是将待克窿片断先克隆到通用大肠杆菌载体的多克隆位点区，或直接测序或根据需要再克隆到其他载体上。大肠杆菌质粒多为一些双链、环 状的 DNA 分子，其大小范围从 1Kb-200 以上 Kb 不等，它们是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒的存在能赋于菌体一些特殊的表型，这些表型主要有对抗生素的抗性、修饰酶等。质粒 DNA 的提取根据实验目的不同，可以有不同的方法，但基本步骤多为三步，第一细菌培养和质粒的 扩增，第二 细菌菌体的裂解，第三质粒 DNA 的纯化。菌体裂解方法不同，决定了质粒 DNA 提取方法的差异，目前菌体裂解方法主要有煮沸法，SDS 法，碱
24、解法,Triton-溶菌酶法等。质粒 DNA 的纯化方法主要有梯度离心法、柱层析法等，但由于目前所用质粒的复制量极大，小量常规制备的质粒既可以满足内切酶图的绘制、细菌转化、特定 DNA 片段的分离、常规亚克隆及探针标记等方面的工作需要。在质粒 DNA 提取中，质粒 DNA 的质量和产量在很大程度上受培养条件的影响,通过一些实验发现,下列培养方式能获得较好的结果：1 培养应用菌龄不超过 4 天的平板单菌落作为起始菌2 培养菌应在 37,220rpm 下,生长 16-18 小时3 不能用经储藏的培养菌直接进行质粒提取制备。下面介绍几种质粒 DNA 提取的方法：方法一 : 碱解法提取 质 粒 DNA
25、本方法适合于质粒 DNA 的微量提取一： 仪 器超净工作台、超级恒温器或恒温水浴、台式离心机、培养箱、取液器、摇床、冷冻真空干燥器、低温冰箱或冰柜、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪二： 试剂：Solution 50mM 葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0)10mM EDTA(pH 8.0), 高压灭菌，4 保存：Solution II 0.2M NaOH, 1% SDS, 现配现用：Solution III 5M KAC 60ml,11.5 冰乙酸， 28.5 水，4保存：3M NaAC pH 5.2 高压灭 菌，4保存：氨苄青霉素 50mg/ml,：溶菌酶：酚/ 氯 仿/异戊醇(25
26、/24/1)：异丙醇：LB 培养基10:电泳试剂见附11:TE 缓冲液三：操作步骤 含氨卞（100ug/ml）的 LB 培养基 培养菌体 37 200rpm 过夜吸取 1.5ml离心，5000rpm,1min沉淀( 充分去除 LB 培养液)加入预冷的 100ul Solution ,充分振荡悬浮加入 200ulSolutionII,颠倒徭匀后冰浴中 3-5min,加入 150ul 预冷 Solution III 混匀, 冰浴 5min离心,12000g,5min取上清酚/氯仿/异戊醇、氯仿各一次，离心 5000g 5min上清0.6 体积的异丙醇,室温,5min, 离心,12000g,5min
27、沉淀 冷冻干燥 悬于 50ldd水或 TERNA 酶至 20ng/ul37-65，30-60 分钟(可不做)酚/氯仿、氯仿抽提、乙醇沉淀（-70 ，15min/-20,2 hr）离心 10000g，5-10min沉淀 冻干 复溶-20保存电泳鉴定注：试剂中所用葡萄糖有增加粘度，降低剪切率，减少 DNA 的降解：试剂中所用 EDTA 有抑制 DNase 的作用，还能降低离子浓度，而高浓度离子对溶菌酶有抑制作用。：试剂中所用 NaOH 能使 DNA 变性， KAC 能使 DNA 复性，并有助于蛋白等其它大分子成分沉淀。4：如 A,不用酚/氯仿抽提;B,LB 培养基残留；C，提取中在溶液 II 中时
28、间过长，导致共价闭合环状 DNA 不可逆变性，则可能影响酶 切。质粒提取方法还有很多，如要进行重组质粒的植物转化或质粒测序则应进行氯化铯梯度离心，或直接采用试剂盒提取。另试剂盒提取可同时进行许多质粒的提取，能在最短时间内获取高质量、高浓度的质粒 DNA如果要提取大质粒 DNA 则建议使用溶菌酶裂解细胞，以 释放质粒 DNA实验 四： DNA 片断的 酶 切技 术限制性内切酶是一类能识别双链 DNA 分子中特异核苷酸序列的 DNA 水解酶,这类酶的发现和应用促进了以 DNA 重组为基 础的生物工程技术的迅猛发展。该类酶是体外剪切基因片段的重要工具，基因物理图谱的绘制、核苷酸序列的测定、基因片段的
29、重组，重组子的筛选、探针的制 备及各种杂交、测量基因的拷贝数,基因文库构建,分子标记等都离不开限制性内切酶的应用。另外以限制性内切酶为基础的各种限制性内切酶片段长度多态性分析，促进了分子遗传学、分类学等相关学科的应用和发展。可以这么说，没有限制性内切酶的发现和应用就没有现代意义上的分子生物学、分子遗传学，也就不会有任何基因工程产品。而对 于从事分子生物学或相关领域研究工作的人员讲来，如果不能很好地了解和掌握内切酶技术，那就根本不可能开展这方面的任何工作。本部分实验主要通过 EcoR，Hind III 两种限制性内切酶对 DNA的单酶切、双酶切及部分酶切的操作，使学员能掌握内切酶的实验操作技术一
30、： 仪 器：离心机 、 恒温水浴 、取液器、 电泳仪 、电泳槽、 紫外观测仪二： 试剂 EcoR,Hind ,DNA/Hind及 DNA/EcoR 标准 质粒（或其他 DNA 样品）（浓度 0.5g/l） TAE 缓冲液三：操作(一)EcoR 、Hind 单酶切及双酶切1, 取支干净、 灭菌新 Eppendof 管，分别按下表加入(l) B(l)灭菌水 3 3 EcoR 缓冲液 Hind 缓冲液 DNA （或质粒 DNA ） 4 4EcoR Hind 总体积 ，37保温4 小时3，保温结束后 65-7010min 灭活酶(如为热稳定性 酶,则用氯仿抽提)4，取 2l左右的反应液加入 2l电泳加
31、样缓冲液，电泳（二）EcoR 、 Hind III 双酶切1,取一支干净、灭菌 Eppendof 管，按下表加入各种试剂加入试剂 体积（l）灭菌水 1MULT buffer 2DNA（或质粒 DNA） 4EcoR Hind 总体积 2 ，37保温小 时，保温结束后 65-7010min 灭活酶(如为热稳定性 酶,则用氯仿抽提)，取 2l左右的反应液加入 2l电泳加样缓冲液，电泳注意： ，样品加入次序为水、 缓冲液、DNA 最后为酶，不应颠倒，加酶步骤要在冰浴中进行，在加 酶前应先将水、 缓冲液及待切 DNA混匀，反应体积中水的量要尽量少，即反 应体系的体积要尽量少，一般水解0.2-1ug 模板
32、 DNA 时， 应将体积控制在 2030ul 内。但要保证所加酶的体积不高于总体积的 1/10,因为限制性内切酶是保存于 50%甘油中的，如加 酶体积高于总体积的 1/10,则反应液中甘油浓度将大于，而此 浓度将抑制内切酶活性。4，为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板 DNA 的浓度应很高，否则反应体系中 DNA 浓度太低则将引起酶反应动力学改变、降低 酶解效果，此时不得不增加反应体积；而一般为了增加 DNA 储藏的稳定性， DNA 多保存在TE 缓冲液中，如反应体系中过多加入模板 DNA 溶液则势必造成反应体系中EDTA 浓度升高，而对酶产生抑制。因此如底物 DNA 浓度过低则应进行浓缩
33、。5，本实验中双酶切时，因两种 酶的缓冲液盐浓度要求相同，所以，可在同一反应体系中完成双酶切。但如进行双酶切时，两种酶所需缓冲液盐浓度要求不同，则不能将两种酶同时加入同一体系， 进行反应，此 时可采取下列处理办法a:先用在低离子强度的缓冲液中活性最高的酶切割 DNA，然后加入适量的 NaCL 及第二种 酶，继续保温。b:使用所有限制酶均可作用的单种缓冲液(谷氨酸钾缓 冲液)。C:一种酶水解完后， 进行有机溶剂抽提，沉淀、干燥后再复溶然后进行第二种酶切。在上述 3 种方法中遇到最多的可能为 C6，在水解结束灭活酶时可采用 65加热 10 分钟或加 EDTA 至终浓度10mM，二者各有利弊，加热简
34、单但对有些酶灭活不 彻底。 EDTA 对酶的灭活彻底，但 EDTA 存在将使连接反应变得极为困难，因此在连接前要求重新用有机溶剂抽提，这将增加操作难度和导致 DNA 的损失。有关 DNA 限制性内切酶使用中的一些其他问题可参见附录。实验 五 :酶 切片断的脱磷技 术在对 DNA 片段的修饰中，脱磷酸化反 应是一个重要内容 ,该反应有碱性磷酸化酶催化，该酶可使线状 DNA 上去除 5磷酸基团，而 DNA 的脱 5磷酸基团是基因重组、载体构建中防止载体 DNA 自身联接、环化的重要途径，载体经单酶切线性化后,3端为羟基、5端为磷酸基，在连接酶作用下将以极大比例发生载体自连,而 5脱磷后,载体在 5
35、与 3位均为羟基不能自连只有与带 5磷酸基的外源片断连接,载体与外源片断间形成一个磷酸二脂键和一个缺口,缺口在转移进细胞后修复.另外脱磷作用还可发生在 RNA、DNA、三磷酸腺苷、脱氧三磷酸腺苷的 5端，这个反应是进行探针标记操作中的重要环节。一： 仪 器 离心机 恒温设备 真空干燥机 取液器二： 试剂 碱性磷酸酶、DNA 酶切片段、酚、氯仿、0.5M EDTA(pH 8.0) 、SDS、 TE缓冲液、 电泳缓冲液、7.5M NH4AC(pH 7.5)碱性磷酸 酶缓冲液： 10mM ZnCL10mM MgCL100mM Tris-HCL(pH 9.0)三：操作：在实验四所得 DNA 限制性内切
36、酶片段中加入10碱性磷酸酶缓冲液 10l碱性磷酸酶(0.01u/pmol ends) 1-2ulddH2O 到 100ul对于 5突出则 37下温浴 30 分钟,再加入 1ulCIAP(0.01u/pmol ends), 37下温浴 30 分钟.对于平末端或 3突出末端,则 37下温浴 15 分钟,56 下温浴 15 分钟, 再加入1ul CIAP(0.01u/pmol ends), 37下温浴 15 分钟. 56 下温浴 15 分钟：温浴结束后加入 EDTA(pH 8.0)至终浓度分别为 10mM，65加热 20min，以灭活碱性磷酸酶：用酚、氯仿各抽提一次：加入 1/2 体积 NH4AC，
37、充分混匀，再加入体积的乙醇，20 放置2hr（或 7030 分钟），12000g 离心 10 分钟，沉淀 DNA。：冷 70%乙醇洗沉淀一次：TE 溶解（终浓度为 100g/l），-20保存四 :检测将脱磷片断中加入连接酶,以加入连接酶的非脱磷片断作为对照,连接反应后,Agarose 电泳分析,脱磷片断不能 连接,而非脱磷对照片断能连.注： 1, pmol ends=3.04ugDNA/DNA 的碱基数2，在上述几个实验中，有机溶剂沉淀时所用 NaAC 的 pH 最好为 7.2 或用 7.5M的 NH4AC，如用 pH5.2 的溶液则有可能导致 EDTA 沉淀量增加，影响以后的连接反应。3,碱
38、性磷酸酶有两类 BAP（细菌碱性磷酸酶）和 CIP（小牛肠道碱性磷酸酶），因BAP 耐热， 灭活时必须采用有机溶剂抽提法，而 CIP 在 6810SDS 条件下级可灭活，因此实验中一般都采用 CIP。实验 六 : 基因的重 组连 接技 术DNA 酶切片段的连接是分子生物学实验中又一关键技术， 该技术是基因重组，基因改造的重要中间环节。两 DNA 片段相邻的 5磷酸和 3羟基间可由连接酶催化形成磷酸二酯键，这 个连接反应在体外一般都有大肠杆菌 DNA 联接酶和 T4DNA 联 接酶催化，但分子生物学实验中主要采用 T4DNA 联接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连 接反应。在分子生物学 实验中连
39、接酶主要用于 1)基因重组中载体与外源基因的连接；2) 接头与 DNA 片断的连接， 这种连接一般发生在文库构建、分子标记 的 AFLP 及差异表达的研究等中。连接反应可在溶液中进行也可在琼脂块中进行。本课程中在 AFLP、文 库构建、PCR 片断的克隆等中均有连接的内容，在本部分仅以重组克隆为目的介绍相应的连接类型。在基因重组克隆中外源 DNA 与载体的连接是承上启下的一步操作，根据 连接片断末端类型不同，连接方式有粘端连接、平端 连接等和平粘端连接及单碱基配对的 T载体连接。其中粘端 连接的效率最高，粘端连接与平粘连接中外源DNA 片断在载体中的插入有方向性。平端连接的效率最低，且载体发生
40、自连的比例较高，因此在克隆操作中为了克服平连的弊端，通常可通过 1)TdT 酶在载体和外源 DNA 片断上转移一互补序列（核苷酸投影法）；2)在载体和外源 DNA片断上加上人工接头，变平连为粘连。下面 拟通过 T4DNA 联接酶对酶切片段的连接操作，使学员掌握这一 DNA 片段的连接操作技 术。A ：溶液中 连 接一： 仪 器 离心机、恒温设备、真空干燥机、取液器二： 试剂T4DNA 联接酶10T4DNA 联接酶缓冲液200mM Tris-HCL (pH 7.6)、50mM MgCL2、5mM ATP、50mM DTT500g/ml 牛血清白蛋白(可不用) DNA/HindIII 酚/氯仿、
41、酚、氯仿、 TE 缓冲液、 电泳缓冲液、3M NaAC(pH 5.2)三 :操作：1:取干净、灭菌 Ephondof 管，安下表加入各 试液T4DNA 联接酶缓冲液 1ul载体 DNA 片断 1ng插入目的片断 Xng连接酶 1u(平末端,如为粘端连接,则酶量可小于 1u)加无菌水到 10ulX=目的片断与载体片断的分子比例 载体 ng 数目的片断的碱基数/ 载体 ng 数（目的片断/载体片断的分子比例一般为 3/1）2:连接反应22保温 3 小 时或 4过夜 (Promega 连接酶,粘端连 接)或 22-261hr(BRL 连接酶 ,粘端连接)或 224-16hr(Promega 连 接酶,平端连接)或 1416-24hr(BRL 连接 酶)B ：胶内 连 接： 该方法是一种快速克隆技术，将要重组连接的外源DNA 片断用低熔点琼脂糖分离，在紫外灯下切下待克隆片断，溶化后加入 缓冲液、载体 DNA、连接酶直接连接。这种连接的待克隆片断既可以为酶切基因组片断也可为 PCR 片断，既可平连也可粘连，但连接效率较溶液中连接要低的多，但这种连接省去了待克隆片断的回收纯化操作。这种连接方法要求目的 DNA量、载体量及酶量都要增加。一： 仪 器 ：同 A二： 试剂 ：同 A三：操作1：低熔点
