1、分子生物学实验,2010-2011第二学期,目的：掌握分子生物学基本技术，主要包括RNA提取、反转录、PCR、电泳等 内容：罗非鱼18S基因的cDNA克隆 总RNA提取 电泳检测 cDNA合成 PCR扩增 PCR产物的分离、回收和纯化,时间安排： 5月24日 实验准备一：1.3去除RNA酶的实验用品处理 5月25日 实验准备二：灭菌干燥离心管、枪头 5月26日 总RNA提取和电泳检测 5月27日 cDNA合成和PCR扩增 5月28日 PCR产物回收和纯化,要求： 1、分组实验，以小组为单位进行考核，即以各小组实际的实验结果进行评分，不另外安排考试。 2、实验结果主要包括：总RNA电泳图、PCR
2、电泳图，每小组交一份实验报告，实验报告需对实验结果进行分析讨论。,1 材 料 1.1 实验鱼罗非鱼购自农贸市场，碎冰速冻麻醉后分离垂体、肝脏组织，立即置于TRIZOL试剂，或置于-60超低温冰箱保存。 1.2 试 剂 柱式动物RNAout（总RNA 提取试剂盒） RevertAid TM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit（反转录试剂盒） ExTaq PCR kit（PCR反应试剂盒） E.Z.N.A Gel Extraction Kit（胶回收试剂盒） 100bp DNA Ladder,1.3 去除RNA酶的实验用品处理 DEPC水：每1L双蒸水中
3、加入1mL DEPC，终浓度为0.1%， 于室温搅拌过夜，高压灭菌。 金属解剖器具和玻璃器皿经180烘烤5小时，以灭活RNA酶。 塑料离心管、枪头及枪头盒等塑料用品均用DEPC水浸泡过夜后，高压灭菌烘干后使用。 琼脂糖凝胶电泳槽、制胶模具用3%的过氧化氢浸泡过夜后，用DEPC水洗净备用。,1.5移液枪的正确使用 选择合适量程； 对应合适枪头； 吸液后轻放以避免将液体吸入到枪体内； 用完后调回最大量程。,1.6安全注意事项 DEPC：焦碳酸二乙酯，是强的蛋白变性剂和致癌物。开瓶时要使瓶子尽可能远离操作者，因为内部的压力可能导致飞溅。操作中应戴上手套，并在通风厨中进行； 有机溶剂：RNA提取试剂为
4、有机挥发试剂（硫氰酸胍-苯酚、氯仿、异丙醇），均有毒，需在通风厨操作或屏息操作，少讲话，以免将有毒气体吸入体内。若试剂不小心沾到皮肤上，请立即用自来水冲洗； EB：溴化乙锭，是诱变剂，具有高致癌性，配制使用时，应戴乳胶手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是接触过EB的器皿或物品，必须经特殊处理后，再进行清洗或弃去。,实验相关知识及操作方法,RNA提取 琼脂糖凝胶电泳 PCR及反转录,二、RNA提取的基本原理与方法 （一）总RNA提取的基本原理与方法 1、原理 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可
5、能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。 提取步骤： 破碎组织分离RNA沉淀RNA洗涤RNA融解RNA保存RNA。,所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即： 样品细胞或组织的有效破碎； 有效地使核蛋白复合体变性； 对内源RNA酶的有效抑制； 有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离； 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:1、提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2、直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。,2、总RNA提取的方法 （1）（异硫氰酸
6、胍-酚-氯仿一步法）TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。,（二）mRNA的提取 mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异
7、地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。,总RNA提取（柱式动物RNAout） 从低温冰箱(80)中取出肝脏样品，剪取小块（约为50-100mg）后加入1 ml的溶液A，用1ml一次性塑料注射器抽打匀浆。 匀浆液室温放置（1530）1分钟以便细胞充分裂解，每1 ml 溶液A加入0.2 ml的氯仿，用力振荡30秒后，室温放置1分钟以便溶液分层，总RNA存在于上层水相中。 室温，12,000g离心3分钟，将上清液移至干净的1.5 ml离心管中，加入相同体积溶液B，颠倒混匀。,将溶液置于离心柱中，静置2
8、分钟，8000rpm离心30S，若一次加不完，可分两次离心。 用通用洗柱液洗两次。 短暂干甩后，用RNA洗脱液洗柱，室温离心干燥30S ，溶解总RNA。 0.8琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。,RNA提取注意事项：为防RNA降解，带手套、口罩，少说话；试剂均为有机挥发试剂，有毒，需在通风厨操作，屏息，若不小心沾到试剂立即用自来水冲洗,（二）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴
9、化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。,一、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。,Section2 凝胶电泳,步骤： 将凝胶成形模具两端用医用胶布封好，水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与模具之间留1mm空间。 称取DNA电泳用琼脂糖0.8g放入250ml的三角烧杯中，加入100m
10、l 1TAE缓冲液，混匀后，将烧瓶置于电炉上，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。 关闭电炉，取下三角烧瓶，将其置室温下冷却至70左右（手握烧瓶可以耐受），再加入溴化乙锭（10mg/ml）5l，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。,室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，揭去两端胶布，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中。 在电泳槽中加入1TAE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜。 将样品置震荡器上混匀，短暂离心。用加样器吸取样品。依次分别加入三个点样孔中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。 接通电源，调节电压至50伏，电泳90分钟后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果。,
11、影响DAN片段琼脂糖电泳的几个因素： DNA分子的大小：线性DNA分子的迁移率与其分子 量的对数值成反比。 DNA分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快，线性DNA分子比开环DNA分子快。 琼脂糖浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。 电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。,PCR技术：1985年由美国 Cetu
12、s 公司的Kary Mullis 首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。Kary Mullis 本人因此获1993年诺贝尔化学奖。,聚合酶链式反应技术,DNA扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂，需数周到数月的时间，且不利于普及。,一、
13、PCR的原理：用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。,（一）PCR技术的基本过程 扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94 30 2. 退火 (复性) (Annealling):突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两
14、条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55 30 ,3. 延伸 (Extension):将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物的 3端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。72 1上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2540个循环后DNA可扩增106 109 倍。,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,PCR技术原理,PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。
15、反应初期，原来的DNA担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5 端之间的DNA片段。,二、PCR反应体系：终浓度 缓冲液：10 50 mM Tris- Cl (pH8.4)维持 Taq 酶作用环境的偏碱性25 50 mM KCl促进引物退火，50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。100g / ml 牛血清白蛋白 (BSA)对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、 二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。,2、MgCl2: （1.52.0mM）Taq 酶具有 Mg2+依
16、赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。 3、dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP底物（0.020.2 mM）dNTPs 可与 Mg2+ 结合，应注意Mg2+ 浓度与dNTPs 浓度之间的关系， Mg2+ 浓度比 dNTPs 浓度高 0.2 2.5 mM。 过高：加快反应速度，但增加碱基的错误掺入率和室验成本。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。,4. 引物 (Primer-P)：（0.2 1 M）预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。 偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间 形成引物二聚体，产量降低。偏
17、低：产量降低。 5. Taq DNA 聚合酶：耐高热0.5 5 U / 100 l 1U / 25 50l偏高：引物非特异产物的扩增偏低：产物量降低,6. 模板DNA (Template):最低102 105 bp DNA片段，实际用量远远超过此量，用量需在实验中摸索。1 5 l过高：非特异产物增加过低：产量降低 7. 水：去离子水，补足整个反应体积。,PCR反应体系：常用30l，各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。10buffer： 130 / 10 = 3lMgCl2: 1.530 / 25 = 1.8ldNTPs: 0.230 / 10 = 0
18、.6l引物 P： 0.4302 / 10 = 2.4lTaq 酶(5U/l)： 1/5 = 0.2l模板： 1l水： 30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21l,操作： 5份标本 总体积 30l 6 = 180l1. 取一 0.5 ml Ep 管，依次加入下列试剂：10buffer： 3l 6 = 18lMgCl2: 1.8l6 = 10.8ldNTPs: 0.6l6 = 3.6l引物 P： 2.4l 6 = 14.4lTaq 酶 (5U/l)： 0.2l 6 = 1.2l水： 21l 6 = 126l共174l，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时混匀（管壁上液体沉至管底）。,
19、2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29l。 3. 分别取标本模板各1l，加入上述5支 Ep 管中，混匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。 4. 反应条件：PCR扩增仪9430，55 30 ，72 1，35个循环，72 延伸 5 。,三、PCR技术的应用 （一）反转录PCR（RT-PCR） RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中
20、RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。,cDNA的合成（反转录试剂盒） （1）在PCR管中加入： 9l DEPC水 4l 5buffer(含有25mM Mgcl2) 2l RNA 2l dNTP(10mM) 1l oligo（dT）(10pmol/l) 1l inhibitor （10u/l） 1l 反转录酶（200U/l） （2）PCR管中共20l.振荡混匀后用小离心机离心。 （3）42 反应45分钟后，99 反应5分钟终止反应。 （4）样品直接进行PCR反应或贮存于20 备用。,注：反转录酶-20度保存，加样时最后加，加样时从-20度取出，加完后直接放回-20度冰箱保存。,2.3 PCR扩增（PCR反应试剂盒） PCR反应程序为：94预变性3分钟； 94变性30秒； 50退火30秒； 72延伸1分钟； 72延伸30分钟； 4保存PCR产物。,30个循环,PCR扩增体系：,注：Taq DNA polymerase-20度保存，加样时最后加，加样时从-20度取出，加完后直接放回-20度冰箱保存。,
