1、,第15章 分子发光分析法Molecular Luminescence Analysis,第15章 分子发光分析法（Molecular Luminescence Analysis）,15. 1 光致发光的基本理论15. 2 荧光分析法15. 3 磷光分析法15. 4 化学发光分析法15. 5 分子发光分析法的应用,分子吸收能量，电子由基态进入激发态，当电子由激发态返回基态时发射光谱 , M + 热量 M + h + 热量,15. 1 光致发光的基本理论 p.352,荧光 磷光 F P寿命 10-710-9s 10-310s,第15章 分子发光分析法,光子 光致发光 M+ h M 化学反应能化学
2、发光 M+化学能M,1.1 激发态,荧光 涉及吸收和发射两个过程,15. 1光致发光的基本理论,15. 1 光致发光的基本理论 p.352,第15章 分子发光分析法,基态 激发态 分立轨道上 非成对电子 平行自旋更 n 稳定 n 净电子自旋 S=0 S=0 S=1 分子重态 M=2S+1=1 （跃迁几率很小） M=2S+1=3 单重基态 S0 激发单重态 S 激发三重态 T 电子从 S0 到 S 分子能量相应增加改变了分子对称性、 分子净的电子自旋（多重性）可能改变,1.2 去活化过程,15. 1光致发光的基本理论,第15章 分子发光分析法,15. 1光致发光的基本理论,第15章 分子发光分析
3、法,(1) 气相分子中易观察到以发射光子方式失去振动能 (2) 实现内部转换 a. S1S2 电子能级差小 、易实现 b. S1S2 振动能级的位能面有交叉 (3) 体系间跨越的必要条件 a. S1T1位能面在某处有容易达到的能量相交 b. 微观磁场的微扰存在 (4) 外部转换使发光熄灭现象 T1 S0 比 S1 S0 可能性更大 (5) 去活化众多过程中，以速度最快、激发寿命最短的途径占优势，相互竞争。,1.2 去活化过程,15. 1光致发光的基本理论,第15章 分子发光分析法,1.3 激发光谱与荧光光谱,光致发光 吸收辐射和发射辐射两个过程 荧光化合物 激发光谱 和 荧光光谱 发射光谱,第
4、15章 分子发光分析法,15. 1光致发光的基本理论,1.3 激发光谱与荧光光谱,em.max处 IFex,ex,max处，激发光强度不变 IFem,第15章 分子发光分析法,15. 1光致发光的基本理论,1.3 激发光谱与荧光光谱,特征：、实际测得的荧光光谱和激发光谱随仪器而异,其真实光谱必须要对其光源、单色器、检测器的光谱特性加以校正； 、真实的激发光谱与吸收光谱非常相似，而不是相同,第15章 分子发光分析法,15. 1光致发光的基本理论,1.3 激发光谱与荧光光谱,注意：、荧光光谱与激发光谱峰中长波长处大致呈镜像对称 、荧光光谱峰波长em激发光谱峰波长ex,第15章 分子发光分析法,（1
5、）斯托克斯位移（荧激） 原因 非辐射损失 溶剂化效应 （2）荧光光谱与激发光波长无关系 原因 第一激发态的最低振动能级（3）荧光光谱与激发光谱大致呈镜像对称关系 光谱形状决定于S1、S0的振动能级分布相似,15. 1光致发光的基本理论,1.4 溶液荧光光谱的特性,第15章 分子发光分析法,(1) 荧光分子的平均寿命 返回基态之前分子耽搁在激发单重态的平均时间(2) 荧光的量子产率 f 发射荧光的光子数吸收辐射的光子数,1.5 荧光发射的两个重要参数 p.360,15. 1光致发光的基本理论,第15章 分子发光分析法,(1) 强荧光物质的结构 （请阅读课文） （荧光和结构的关系，对象的选择） （
6、a） 比 n 有利 f （b） 共轭 体系 f （c） 刚性平面结构 f （d） 取代基影响 给电子基团 f 吸电子基团 f(p ) 取代基位置:邻、对f 重原子取代基f ( p ),1.6 影响荧光发射的因素 p.362,15. 1光致发光的基本理论,第15章 分子发光分析法,(2) 溶液环境因素 （a）溶剂效应 取决于荧光体和溶剂的化学结构 极性 重原子溶剂存在时重原子效应 对f.max、f 均有影响 （b）温度 T f （c）pH 平衡解离关系 对f.max、f 均有影响,15. 1光致发光的基本理论,1.6 影响荧光发射的因素 p.362,第15章 分子发光分析法,荧光物质分子与溶剂分
7、子或溶质分子之间相互作用而导致荧光强度下降的现象称为荧光的猝灭（或熄灭） 引起荧光猝灭的物质称为荧光猝灭剂。 荧光猝灭过程的实质是，猝灭过程与发光过程相互竞争，缩短了发光分子激发态寿命的过程。,15. 1光致发光的基本理论,1.7 溶液荧光的猝灭 p.364,15. 2 荧光分析法,2.1 荧光的测量,2.2 荧光定量分析的基础 p.362,2.3 荧光定量分析的一般方法 p.366,2.4 荧光分析法的特点,第15章 分子发光分析法,第15章 分子发光分析法,一般荧光分光光度计与紫外可见分光光度计的异同,2.1 荧光的测量,区别：1）垂直光路； 2）两个单色器，选择ex和em ； 3）检测
8、IF （光源强）,15. 2荧光分析法,第15章 分子发光分析法,荧光分光光度计光路图,15. 2荧光分析法,第15章 分子发光分析法,荧光强度 IF 与荧光物质的溶液浓度 c 成线性关系 荧光定量分析的基本关系式,IF = 2.3F I0 b c,b - 试样的吸收光程, - 摩尔吸光系数,F -荧光发射的量子产率,IF - 荧光强度,当 I0 及 b 一定时，,稀溶液：,c - 试样浓度,IF = k c,I0-入射光强度,15. 2荧光分析法,2.2 荧光定量分析的基础 p.362,第15章 分子发光分析法,15. 2荧光分析法,2.3 荧光定量分析的一般方法 p.366,标准曲线法确定
9、 ex 和 em（激发光谱和发射光谱）确定适宜的工作条件：试剂浓度, pH, T, t 等以系列标准溶液作出标准曲线；测得未知样的荧光强度 IF，根据标准曲线计算荧光物质的浓度,第15章 分子发光分析法,荧光猝灭工作曲线法,直接荧光标准曲线法,不同 ：利用荧光的猝灭，测定猝灭剂的浓度,15. 2荧光分析法,荧光猝灭法,第15章 分子发光分析法,灵敏度高：测定下限在0.10.001 g/mL 比分光光度法高24个数量级。 光强I与I0的信号差别 荧光发射的光强选择性高：适当选择激发光波长和荧光测定波长 产生荧光的化合物有限，不及分光光度法广泛 干扰物质较少,2.4 荧光分析法的特点,15. 2荧
10、光分析法,第15章 分子发光分析法,15. 2荧光分析法,第15章 分子发光分析法,15. 2荧光分析法,1. 磷光与荧光的不同 峰值波长 PF，寿命长 p F2. 磷光测量方法：与荧光分析法类同3. 常规（低温）磷光法 a. 低温测量 减少非辐射跃迁对磷光发射影响，液氮 b. 定量关系式 Ip = 2.3pI0b c = Kpc,15. 3磷光分析法,第15章 分子发光分析法,15. 4化学发光分析法,1. 实现化学发光条件： 化学发光反应必须提供足够的能量，使基态分子激发。 如：氧化反应、裂解反应 要有有利的化学反应历程， 反应的能量至少能被一种物质分子所吸收至S1 要观察到化学发光，即S
11、1 能发射 h。,第15章 分子发光分析法,化学反应时产生的化学能使产物分子激发 R P* P + h 或 R P* A* A + h,A,第15章 分子发光分析法,2. 化学发光效率 化学发光总量子产率 （与荧光量子产率联系比较） CL = = CEEM,3. 定量关系：,根据测定已知时间范围内发光总量，对反应物定量测定,15. 4化学发光分析法,ICL(t)dt = CLc y = a x,化学激发效率,激发态分子发光效率,15.5分子发光分析法的应用,第15章 分子发光分析法,本章小结,* 荧光、化学发光等基本概念* 荧光分析法进行定量分析的基本关系式及定量方法* 荧光分析法的特点、荧光光度计的基本构成与特点* 分子发光分析法在生物学中的应用,
