1、分子细胞遗传学实验,1.严格遵守实验室安全管理制度 2.严格按照实验要求进行实验 3.实验分组5人一组,可以自由组合,平时成绩, 考勤和课堂表现, 50% 实验及实验报告, 50%实验报告评分细则 实验原理 10分 实验目的 5分 仪器材料和试剂 10分 实验步骤 20分 实验结果与分析 45分 (其中,实验结果20分, 结果分析25分) 心得体会 10分,考试成绩,实验一、质粒DNA的提取,一、实验目的,二、实验原理,三、实验器材与试剂,四、实验步骤,一、实验目的,学习和掌握试利用试剂盒碱裂解法提取质粒用于原位杂交探针的标记,二、实验原理,在pH值介于12.0-12.5范围内 线性的DNA双
2、螺旋结构解开而被变性,当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时， 共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确， 线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。,碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。,共价闭环质粒DNA的氢键会断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。,三、实验器材与试剂,1仪器：恒温培养箱，恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅。2材料：含质粒的大
3、肠杆菌，1.5mL 离心管，吸头，移液器。3试剂：质粒小量制备试剂盒(质粒DNA小量提取试剂盒, 天根公司)常用碱法提取质粒的溶液的参考配方：Solution I 50mmo1L 葡萄糖； 25mmo1L TrisHCl(pH8.0)； 10 mmo1L 乙二胺四乙酸； EDTA)pH8.0Solution II 0.4mo1LNa0H，2SDS(十二烷基硫酸钠)，使用前等体积混合Solution III 5mo1L 乙酸钾 60mL； 冰乙酸 11.5mL； 灭菌水 28.5mLTE缓冲液 10mmo1L TrisHCl； 1mmo1L EDTA(pH8.0)； RNA酶(RNA酶A) Tr
4、isHCl(pH7.5)、15mmo1L NaCl中，配成10 mgmL的浓度，于100加热15min， 缓慢冷却至室温，保存于-20。 70%乙醇（放-20冰箱中，用后即放回）,四、实验步骤,I 培养细菌（已完成）,II 收集和裂解细菌III 纯化质粒DNA,正式实验前，请学习移液枪的使用,柱平衡步骤：加入500L 的平衡液BL，12,000 rpm (13,400g ) 离心1 分钟。倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2. 取1-5 mL(3mL)过夜培养的菌液，10，000 rpm 离心1 分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。3. 向
5、留有菌体沉淀的离心管中加入250 L 溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。4. 向离心管中加入250 L 溶液P2，温和地上下翻转68 次使菌体充分裂解。5. 向离心管中加入350 L溶液P3，立即温和地上下翻转68 次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。10,000 rpm离心10 分钟。6. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3 中 （吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。10,000 rpm 离心30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。,8. 向吸附柱CP3 中加入600 L漂洗液PW ，10，000 rpm离心60 秒，倒掉收集管
6、中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。9. 向吸附柱CP3 中加入500 L 漂洗液PW，10,000 rpm 离心60秒，倒掉收集管中的废液。10. 将吸附柱CP3 放入收集管中, 12,000 rpm (13,400g) 离心2 分钟，将吸附柱中残余的漂洗液去除干净。11. 将吸附柱CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50L ddH2O (或洗脱缓冲液EB)，室温放置 6 分钟，12,000 rpm (13,400g) 离心1 分钟将质粒溶液收集到离心管中。12、离心管中收集的就是洗脱下来的质粒DNA,、质粒的琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶的制备及电泳 1，量筒量取100 ml TAE，倒入容积为250 ml的三角烧瓶2，电子天平称取1g 琼脂糖，倒入三角烧瓶3，摇匀后放入微波炉加热至沸腾2-3次4，室温放置至不烫手为止，加入溴化乙锭（EB，有毒性，请带手套），摇匀后，倒入制胶槽（事先插上梳子），冷却至胶完全凝固（约15-30分钟）。,5. 拔掉梳子，将胶放入电泳槽内（保证电泳缓冲液足够淹没过胶面）6. 将15uL 质粒洗脱液与3uL的DNA上样缓冲液（使DNA沉降至点样孔内+电泳指示剂）混合，加于1% Agarose 做凝胶电泳分析，检测其纯度和目测定量。如果质粒质量较好，则剩余质粒20保存备用。可用于原位杂交探针标记。,
