1、,植物组织培养技术,第一章 绪 论一、植物组织培养的概念(一) 概 念植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。,（二）主要特征1在培养容器中进行；2无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入； 3各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。4通常打破了正常的植物发育过程和格局；5随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。,（三）植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。1.根
2、据培养材料不同分为： 完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。 胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。 器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。 组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。 细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。 原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。,矮牵牛茎尖离体培养培养,牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖 Mature embryo
3、culture and rapid propagation of tree peony,微型月季茎段离体培养,花烛叶片离体快速繁殖,大蒜根尖培养及植株再生,大蒜试管鳞茎诱导,人参细胞悬浮培养,非洲紫罗兰原生质体分离、培养及植株再生,2.根据再生途径分为： 器官发生途径（Organogenesis）：直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。如茎尖培养。间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过程。如叶片培养。 体细胞胚胎发生（Somatic embryogenesis）：体胚发生途
4、径是指二倍体或单倍体的体细胞在特定条件下未经性细胞融合而通过与合子胚发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程。经体胚发生形成类似合子胚的结构称为胚状体（embryoid）或体细胞胚(somatic embryo).,直接器官发生 间接器官发生,体细胞胚胎发生,贯叶金丝桃不定芽直接再生过程,优化培养基 无蔗糖 1%蔗糖 5%蔗糖,无BAP BAP 0.1mg/l BAP 5.0mg/l 无NAA,非洲紫罗兰叶片培养,优化培养基 无蔗糖 1%蔗糖 5%蔗糖,无BAP BAP 0.1mg/l BAP 5.0mg/l 无NAA,台湾百合离体培养,大花蕙兰原球茎增殖与植株再生,器官发生途径（原球茎的形成
5、）：,大蒜愈伤组织培养,日本牵牛花的离体培养,禾本科牧草的体胚发生过程,菊花体细胞胚胎发生及植株再生,大蒜体细胞胚胎发生过程,人工种子（Artificial seed，Synthetic Seed）：是指植物离体培养产生的胚状体或不定芽被包裹在含有营养和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。作为繁殖材料。,3.根据培养基的类型分为: 固体培养（Solid culture）: 琼脂、卡拉胶等固化。半液半固体培养(Semisolid Culture)：固液双层。液体培养(Liquid Culture)：震荡、旋转或静置培养。,液体培养的优点：A 不使用凝固剂，节约生产成本B
6、营养吸收充分；C 操作过程简化。,固体培养：,液体培养,体胚液体培养,不同类型液体培养装置,液体培养体系,菠萝种苗液体培养系统,丹参毛状根培养,二、 植物组织培养发展简史 1、理论准备阶段（探索阶段）（20世纪30年代前） 1667年，虎克（R. Hooke）发现细胞；1756年，Duhamel发现了愈伤组织形成。 18381839， Schleiden(1838施莱登提出植物细胞学说) 和 Schwann（1839年施旺认为细胞学说也适用于动物）创立了细胞学说。 1902年德国的Haberlandt(哈布兰特)：“植物离体细胞培养试验”。提出了高等植物的器官和组织可以不断分割、直至单个细胞，
7、并大胆提出在试管培育植物，预言离体细胞在生理、发育上有潜在的全能性。,即：所有植物的细胞在适当的条件下具有不断分裂和繁殖并发育成独立个体，可增殖，具有分化为完整植株的潜在能力。Cell有全部遗传信息和发育成完整植株的能力，但处于完整植株的生活细胞受整体Cell控制（即gene受阻or other发挥作用），完整植株上Cell细胞只表达一定形态生理功能。,上述阶段仅是探索，没有实质上进展，主要受当时理论水平、科研和设备条件的限制，未诱导出完整植株。,2、发展时期（奠基阶段，30年代中至50年代末）组培的真正建立和发展，从1934年开始才算有了突破。,1933 李继侗、沈同用银杏胚乳提取物培养银杏
8、胚获得成功，（获得3mm以上大小的胚，即可正常生长成小植株）并发现胚乳提取物能促进银杏离体胚的生长，为后人利用植物组织提取液促进培养物生长提供了实验根据。这是首次利用天然提取物。1934年，美国的White（怀特）用无机盐、糖类和酵母抽提物的培养基进行番茄根尖切段培养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖系。无机盐、三种B族维生素、取代酵母浸出液（19341968）继代1600代后仍能正常生长。1943年，white出版了第一本专著植物组织培养手册A Hand Book of Plant Tissue Culture。,1945年F.Skoog和崔澄发现腺嘌呤促细胞分裂、组织成芽。Skoog和催澄在
9、烟草茎段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺苷可以解除生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，而诱导形成芽。 1956年 Miller发现了激动素（Kinetion）其效果为腺嘌呤的3万倍。 1957 Skoog和Miller提出有关植物激素控制器官形成的概念细胞分裂素 茎生长素 根,1958 Reiner and Steward，从胡萝卜愈伤组织和细胞培养中，诱导分化产生了体细胞胚，这是人类第一次实现了人工体细胞胚，并获得个体植株。使Haberlandt愿望突现了，科学证明了全能性理论。,在此阶段，White等的工作建立了植物组织培养的综合培养基，它包括无机盐、有机成分和生长刺激因素，同
10、时建立了植物组织培养的基本方法，成为当今植物组织培养的技术基础。,成功原因： 1植物生长调节物质的应用，突现了对离体细胞生长和分化的控制 2B族V生素对植物细胞生长的重要性认识和采用（1934，white） 3由White和Gautheret发展的基本方法,3 快速发展阶段（60年代以来）可概括为以下四个方面： （1）基础研究领域成绩显著：1962 Murashige & Skoog 在烟草培养中筛选出卓有成效的MS培养基。1965 Vasil & Hildebrandt 由分离培养的烟草单细胞成功培育出完整再生植株。从细胞水平证实了植物细胞具有全能性。,（2）原生质体培养取得突破：1971
11、Takebe 在烟草上首次由原生质体获得了再生植株。再次证实植物细胞的全能性。原生质体培养为外源基因的导入提供了理想的受体，促进了体细胞融合技术的发展细胞水平分子水平,（3）花药培养取得显著成绩：1964 Guha 首次实现了花药的离体培养。该技术主要用于遗传育种工作，可大大缩短育种周期，提效率。我国科学家在烟草、水稻、小麦的单倍体培养中取得了重要成绩。,（4）微繁技术得到广泛应用：1960 Morel 提出了离体快繁兰花的方法。“兰花工业”现在微繁技术已经广泛用于各经济作物的生产，并可以与茎尖分生组织培养脱毒技术结合起来在无毒种苗的繁育中发挥作用。,60年代以来，植物组培技术能够得到快速发展
12、，很重要的一个原因就在于走出了实验室，通过与良种选育、遗传育种和植物基因工程技术的结合，在植物改良中发挥了重要作用。,在组培发展史上，我国科学家作出了多方面的贡献。早期的李继侗、罗宗洛、罗士伟、崔瀓等人都作了很多有价值的工作。进入70年代以后，我国科学家在原生质体培养以及花药培养做出了举世公认的重要成绩 得到了世界同行的普遍重视和赞赏。,我国成绩： 我国从70年代开展花药培养单倍体育种和原生质体培养（棉花、玉米、谷子、高粱、大麦）。 全国科技大会以来，我国在组培方面大量研究取举瞩目成就不少科研成果志在世界前列。 我国植物组织培养技术普及程度及技术水平均居世界领先水平（周永青1990） 我国是世
13、界上从事植物组培人数最多，实验室面积最大的国家（陈维伦 1990）。 朱至清研制的N6培养基获国家发明二等奖。 国家“六五”“七五”“八五”和“九五”都把生物技术列为国家重点攻关项目。,三、植物组织培养技术的应用,1、优质种苗的快速无性繁殖：（1）无性繁殖作物及不易繁殖作物的快速繁殖,园艺植物种苗工厂化生产,兰科植物生产,A,B,E,C,F,G,花烛属植物,厥类植物,盆栽及切花植物的繁殖,珍贵树种,无菌苗快速繁殖,无菌苗驯化,组培苗驯化移栽,茎、芽和小植株的规模培养,经济植物快速繁殖,（2）通过茎尖培养生产脱毒健康种苗：如草莓、香蕉、 甘蔗、马铃薯、大蒜等。,virus-free tissue
14、,茎尖培养脱毒,脱毒马铃薯种薯生物反应器液体培养,2、用于植物遗传育种 包括种质资源离体保存； 花粉花药培养产生单倍体； 胚乳培养产生三倍体； 胚培养拯救杂种胚克服远缘杂交障碍； 原生质体培养进行体细胞杂交； 植物体细胞无性系变异诱导和筛选； 用于植物基因转移操作等。,种质资源的离体保存,体细胞无性系变异筛选,花粉、花药培养产生单倍体植株,幼胚拯救克服远缘杂交障碍,用于基因工程技术创造植物新种质。,3、大规模植物细胞、组织和器官培养生产次生代谢物质；,根培养:正常根培养， 毛状根培养,4、用于植物生长发育理论研究，包括生理学、病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。,植物胚胎发生理论研究,生长发育特性研究,
