1、ICS 点击此处添加中国标准文献分类号DB 36江 西 省 地 方 标 准DB 36/ T XXXXXXXX饲料及饲料原料中呕吐毒素的快速筛查胶体金快速定量法Screening of vomitoxin in animal feeding stuffs Rapid Quantitative Method of Colloidal Gold Technique点击此处添加与国际标准一致性程度的标识文稿版次选择XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施江 西 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DBXX/T XXXXXXXI目 次前 言 .II1 范围 .12 规范性
2、引用文件 .13 原理 .14 试剂和材料 .15 仪器和设备 .26 试样制备与保存 .27 分析步骤 .28 结果表述 .29 重复性 .3附录 A（资料性附录） 胶体金免疫层析快速筛查组件试剂配制与技术要求 .4DBXX/T XXXXXXXII前 言本标准按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由江西省饲料工业标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：江西省兽药饲料监察所、北京勤邦生物技术有限公司、拜发分析系统销售（北京）有限公司、双胞胎（集团）股份有限公司、江西正邦科技股份有限公司。本标准主要起草人：杨琳芬、符金华、李瑾瑾、赵正
3、苗、龙光宗、崔廷婷、廖丰、刘世宁、贺丽丽。DBXX/T XXXXXXX1饲料及饲料原料中呕吐毒素的快速筛查 胶体金快速定量法1 范围本标准规定了用胶体金免疫层析法快速筛查测定饲料及饲料原料中呕吐毒素，为定量筛查方法。本标准适用于玉米、小麦、大米、黄豆、豆粕、花生粕、DDGS等原料中及以玉米粉，小麦粉为主要基质的饲料成品中呕吐毒素的快速定量筛查。定量检测限为0.5 mg/kg (ppm)，检测范围为0.5 mg/kg (ppm)5.5 mg/kg (ppm)。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新
4、版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 20195 动物饲料 试样的制备3 原理本方法应用了免疫层析原理。将氯金酸用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记针对呕吐毒素的单克隆抗体，用喷金法固定于硝酸纤维素（NC）膜上，同时，在硝酸纤维素（NC）膜的显色区域有两个条带：质控带和检测带，质控条带上包被有呕吐毒素抗原，检测条带上包被有抗呕吐毒素单克隆抗体的二抗。试样提取液中的呕吐毒素与检测条中胶体金微粒上的单克隆抗体发生反应，形成氯金酸-抗体-抗原聚合物，此聚合物和剩余的氯金酸-抗体聚合物在侧流作用下移动，当到达质控线时，质控条带上包被的抗原与剩
5、余的氯金酸-抗体聚合物结合发生呈色反应，颜色深浅与试样中呕吐毒素含量负相关，而氯金酸-抗体-抗原聚合物继续在侧流作用下移动，到达检测条带后，与检测条带上的二抗形成氯金酸-抗体-抗原&二抗的聚合物，此条带的颜色同试样中的呕吐毒素含量正相关。由于试样中的呕吐毒素的含量一定，质控带的颜色和检测带的颜色此消彼长，呈相关性。等试验反应平衡后，用读数仪扫描检测条上显色区域内检测条带和质控条带颜色深浅，根据颜色深浅和读数仪内置曲线计算出试样中呕吐毒素含量。4 试剂和材料除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合 GB/T 6682 二级水的规定。4.1 胶体金免疫层析快速筛查组件（参见附录 A
6、）。4.2 呕吐毒素残留检测试纸条。4.2.1 样本提取液。0.1% 的 Triton X-100 水溶液：量取 1L 实验用溶液，加入 1g Triton X-100 ，混匀。商品试剂盒中提供此溶液。4.3 氢氧化钠（NaOH 1 mol/L）：称取 40g 氢氧化钠，加水定容至 1000ml，混匀。DBXX/T XXXXXXX24.4 盐酸（HCL，1 mol/L）：量取 83.33 mL = 1.18 g/mL 的盐酸，加水定容至 1000 mL，混匀。5 仪器和设备5.1 天平：感量 0.01 g。5.2 涡旋仪。5.3 离心机：转速3000 r/min。5.4 微量移液器：20 L2
7、00 L。5.5 聚苯乙烯离心管：50 mL。5.6 读数仪：可测定并显示胶体金定量检测条的测定结果。6 试样制备与保存6.1 试样制备按GB/T 20195要求制备试样。6.2 试样保存将试样于-10-20下避光保存。7 分析步骤7.1 试样提取7.1.1 称取(1.000.01) g 饲料样品至 50 mL 聚苯乙烯离心管中，加入 15 mL 样品提取缓冲液（2.1.3），将瓶塞盖紧，涡动 3 min，室温 3000 r/min 以上离心 5 min，取 100 L 上清液待测。7.1.2 非谷物基质，如果上清液 pH 值小于 6 或大于 8，则需要用 1 mol/L 氢氧化钠溶液（4.2
8、）或 1 mol/L 盐酸溶液（4.3）调节 pH 至 7 左右，然后取 100L 此溶液加入 600 L 样本稀释液（4.1.2），混匀，待测注：不同厂家的呕吐毒素胶体金快速定量条所用的样品制备方法不同，如提供呕吐毒素胶体金快速定量检测条使用说明，则按照使用说明中规定的方法进行操作。7.2 试样筛查7.2.1 将胶体金检测条（4.1.1）从冷藏状态（2-8）取出放置至最适试验温度（23-25）。将读数仪（5.6）打开，按照提示输入样品，检测人员，检测项目，方法等相关信息。将比色卡平放于桌面，用读数仪扫描比色卡上的二维码，等待检测。7.2.2 准确移取 100L 待测溶液（7.1），加入检测条
9、加样孔中，准确计时 5 分钟。7.2.3 孵育 5min 后，用读数仪扫描检测卡，按下读取键，几秒钟读数仪的屏幕上即可显示测试样中呕吐毒素的含量信息。可选择打印，传输，储存此信息。7.2.4 如结果显示：invalid ,如果检测条上质控线（C 线）无色，测试线（T 线）上颜色肉眼可见很深，则表明试样中呕吐毒素含量非常高，可将试样提高稀释倍数，重新进行检测。8 结果表述DBXX/T XXXXXXX3呕吐毒素含量以ppm（mg/kg毫克每千克）表示，由读数仪直接显示和读取。9 重复性在同一实验室，由同一操作者使用相同仪器，按相同的测定方法，并在短时间内对同一被测试对象相互独立进行测试获得的两次独
10、立测试结果的绝对差值大于算术平均值20%的情况不超过5%。DBXX/T XXXXXXX4A A附 录 A（资料性附录）胶体金免疫层析快速筛查组件试剂配制与技术要求A.1 样本稀释液配制（能达到相当效果者均可）磷酸二氢钾 0.2 g十二水合磷酸氢二钠 2.9 g氯化钠 8.0 g氯化钾 0.2 gTriton X-100 0.5 mL加水定容至1 000 mL。A.2 基本要求A.2.1 工作环境要求气温：2325 。A.2.2 抗原要求呕吐毒素半抗原与载体蛋白进行化学偶联，能够达到包被要求。A.2.3 抗体要求用呕吐毒素抗原免疫小鼠，制备针对呕吐毒素的特异性单克隆抗体，能够达到检测要求。A.3
11、 原材料要求A.3.1 样品垫：玻璃纤维或无纺布。A.3.2 金释放垫：玻璃纤维片，免疫金释放时间小于10 min ，释放效率大于90% 。A.3.3 反应膜：硝酸纤维素膜，孔径为0.45 m，4 cm浸润时间不小于140 s。A.3.4 吸水纸。A.3.5 塑料卡盒：丙烯腈、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物。A.4 性能要求A.4.1 准确度DBXX/T XXXXXXX5采用 500g/kg（0.5ppm） 、1000g/kg（1ppm）和 2000g/kg（2ppm）三个浓度水平的样品，每个浓度水平测定不低于 6 次，通过偏差来表达，3 个浓度水平的 6 次重复的偏差均应控制在-20%+20%之
12、间。A.4.2 精密度采用 1000g/kg（1ppm）浓度水平的实际样品，测定不低于 6 次，通过批内变异系数来表达，变异系数应20%。A.4.3 检测限计算 20 份阴性样品测定均值加 10 倍标准差，其结果应小于或等于产品灵敏度标示值。A.4.4 批间稳定性采用 1000g/kg（1ppm）左右浓度水平的阳性样品，用至少 3 个不同批次的试剂条进行实验，每个批次测定不低于 3 次，批内测定取平均值，通过批间变异系数来表达，变异系数应25%。A.5 质控检测阴性质控和阳性质控以验证检测条性能，购买有证的阴性参考样及阳性参考样进行质控，可根据参考样的证书上的真实含量水平对检测体系进行质控。_
