1、实验2 分离以尿素为氮源的微生物,一、实验原理,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,CO(NH2)2 + H2O,脲酶,+ CO2,NH3,筛选原理：,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,原因：因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点
2、，包括营养、生理、生长条件等； 方法： 抑制大多数微生物不能生长 造成有利于该菌生长的环境， 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。,3、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,3、土壤中分解尿素的细菌的分离所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,定容至100ml,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖 氮源：尿素,选择培养基,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长
3、发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,5、培养基选择分解尿素的微生物的原理,二、实验材料,1、配制25mL LB 全营养固体培养基； 2、配制25mL 尿素固体培养基（0.025g葡萄糖，0.12gNaCl，0.12g K2HPO4, 0.25mg酚红和0.5g琼脂糖）； 3、土样。,1、制平板：在60oC左右时，将两只三角瓶中已经灭菌的LB固体培养基和尿素培养基，在酒精灯火焰旁分别倒在两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。 2、制备细菌悬液： 在无菌条件下，将1g土样加到有99mL无菌水的三角瓶中，震荡10min，即成10-2土壤稀释液。依此法制备10
4、-3、10-4和10-5土壤稀释液。取样时，尽量知趣悬液。摇匀，放在试管架上。,二.实验步骤,(3)用涂布法分离细菌： 取10-5 和10-4的土壤稀释液各0.1mL，分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。,(4) 培养分离：将培养皿倒置，在37oC恒温培养箱中培养24-48小时。观察菌落数。 (5)观察：全营养培养基中有较多的菌落，而尿素为氮源的培养基中只有少量菌落。,微生物的培养与观察,在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将
5、变红，说明该细菌能够分解尿素。,分析与讨论： 1、为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？2、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用？,琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选,如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下会被水解，水解后的氨使土壤变成碱性，与其他阴离子形成化合物则会使土壤板结。有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用所形成的氨，有利于自然界的氮循环,3、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？4、与全营养培养基上的菌落数比较，为什
6、么尿素培养基上只有少数菌落？,细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素水解，尿素分解后产生氨，氨为碱性，酚红在酸性环境中为黄色，在碱性环境里变为红色。培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化，标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株可以以尿素为氮源。红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强,能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量。因为人和其他哺乳动物产生的排泄物毕竟是少量的，而且尿素还可以在高温下自然分解，因此，以尿素为氮源的菌群较少,例2在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是A调整期 B对数期 C稳定期 D衰亡期,解析：种内斗
7、争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。,答案：C,1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ）A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌 C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质 2.
8、使用选择培养基的目的是（ ）A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别 3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( )A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,实践训练,A,C,D,4.下列说法不正确的是（ ）A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最
9、大，种类最多。5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（ ）A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐,B,C,例3（2005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。 青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是 ，青霉素是青霉菌的 代谢产物。 在生产和科研中，常选用处于 期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛， 和 比较稳定。 对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后， ，再计算发酵罐中菌体的总重量。,异养需氧型,次级,对数,个体的形态,生理特性,称菌体的湿重 （称烘干后的重量）,下课了,
