1、隐球菌的实验室检测 杨启文 北京协和医院 IFD的诊断和治疗 2 微生物学证据 -临床诊断 镜检： 以下任一病灶处查见丝状菌：痰、肺泡灌洗液、支气管毛刷、窦道析出物 培养： 以下任一病灶处查见丝状菌：肺泡灌洗液、支气管毛刷、窦道析出物 抗原检测： G试验（血浆、血清） GM试验（血浆、血清、 BALF、 CSF） 3 微生物学证据 -确诊 镜检： 无菌病灶处、病理切片 培养： 以下任一无菌病灶处培养阳性： CSF、组织、无菌病灶引流液、血 （ BALF、颅窦标本、尿中培养出真菌不能确诊） 抗原检测： 隐球菌抗原 4 实验室诊断方法 直接镜检 +组织病理 真菌培养 +鉴定 血清学 分子生物学 涂
2、片镜检 隐球菌镜检 KOH 10-20%：皮肤标本 /痰 革兰染色：多染为革兰阳性 六胺银染色 墨汁染色 真菌镜检 W7612 CSF 墨汁染色 ，隐球菌 W7612 CSF 革兰 染色 ， 隐球菌 真菌镜检 某些真菌病可通过显微镜直接检查确诊 如：卡氏肺孢子菌孢囊的检测 错误的阳性结果也会出现： 如：墨汁染色中溶解的淋巴细胞错误认 为新型隐球菌 脂肪滴容易与出芽酵母细胞混淆 10 真菌镜检 真菌培养 真菌培养 12 真菌培养 -不同接种方法 隐球菌培养 Page 14 培养基： SDA、脑心浸液琼脂 （血平皿、巧克力平皿也生长） 孵育温度： 25-30度 鉴定方法：生化鉴定，质谱鉴定，基因测
3、序 抗真菌药物抗菌谱 15 抗原检测 IFIs血清学检测方法 真菌 抗原、抗体、酶、代谢产物 标本类型 真菌（除外接合菌和新型 隐球菌） (1,3)-D-葡聚糖 血清、血浆 曲霉 半乳甘露聚糖（ GM） 血清、 BAL（ CSF?） 新型隐球菌 荚膜多糖抗原 血清、 CSF 念珠菌 甘露聚糖、甘露聚糖抗体 血清、 CSF 念珠菌 烯醇酶 血清 念珠菌 烯醇酶抗体、其它胞浆内抗原的抗体 血清 念珠菌 D-阿拉伯糖醇 血清 曲霉、隐球菌 甘露醇 血清 组织胞浆菌 抗原 血清、尿 G试验 (1,3)-D-葡聚糖(BG) 真菌细胞壁成分50% 广泛存在于各种真菌，除外接合菌 18 b1,6 gluca
4、ns b1,3 PPL bilayer chitin ergosterol b1,3 glucan synthase mannoproteins G试验检测范围 检测底物： (1,3)-D 葡聚糖（ BDG） 诊断：侵袭性真菌感染（ IFI） 检测频率： 2次 /周 真菌细胞壁成分：念珠菌，曲霉， 镰刀菌， 毛孢子菌，卡氏肺孢子菌，支顶孢属，酵母菌属 不能检测：接合菌（毛霉、根霉 ） 19 EORTC/MSG 2008 G试验阳性 Probable invasive fungal disease 除 外 隐球菌病和接合菌病（毛霉、根霉、犁头霉） De Pauw B., et al., CID,
5、 2008, 46:1813-21 G试验 ： 至少连续 2次检测 283名血液病患者， 30名 AML、 MDS念珠菌血症患者， 30名健康志愿者 sensitivity 97%， specificity 93% 连续 2次 G阳性，可提高特异性、 PPV 确诊或拟诊 IFI，平均比出现临床症状和体征早 10d；阳性患者中70%比临床表现早 3天 21 Odabasi Z , et al. Clin Infect Dis, 2004, 39: 199-205 G试验在隐球菌脑膜炎中有无诊断价值？ Page 22 Rhein et al., OFID, 2014, 1-7 G试验诊断隐脑的性能
6、评价 隐脑病人中脑脊液 BDG浓度为 343（ 200-597）pg/ml，非隐脑病人中 为 37（ 23-46） pg/ml。 Page 23 Rhein et al., OFID, 2014, 1-7 不同菌量的隐脑病人中的 G试验敏感性 Page 24 Rhein et al., OFID, 2014, 1-7 CSF中 BDG水平随抗真菌治疗快速下降 Page 25 隐脑 (-) 隐脑 (+) 抗真菌治疗 Rhein et al., OFID, 2014, 1-7 脑脊液 BDG水平与病死率相关 Page 26 Rhein et al., OFID, 2014, 1-7 G试验假阳性影
7、响因素 方法学缺陷 血液透析患者（纤维素膜） 细菌血症、肝硬化、小肠结肠炎 患者使用凝血因子、白蛋白、免疫球蛋白 IV抗生素（ -内酰胺类： AMC/SAM） 抗肿瘤准备：蘑菇多糖、裂褶菌多糖 手术中使用棉纱垫、棉拭子 等 标本溶血、脂血、黄疸 标本污染（床边消毒纱布，实验室环境粉尘） 实验耗材：所有枪头、试管、玻璃管均应无热原 G试验：小结 泛真菌 marker，无法获知是哪种真菌 高 NPV， 连续 2次 G试验 阳性可提高特异性 和PPV， 2次 /周进行监测 IFI早期 诊断 假阳性高 念珠菌定植不引起 G试验升高 动态反应感染程度和抗真菌治疗 疗效 抗真菌药物治疗不影响其敏感性 28
8、 GM试验 诊断：侵袭性曲霉感染（ IA） 检测底物：半乳甘露聚糖 曲霉细胞壁成分 菌 丝 在组织中生长时释放 热稳定 可溶性： serum, BAL, CSF 检测 频率： 2次 /周 交叉反应：马内菲 青 霉（多种青霉、拟青霉）、 深红酵母、 新型隐球菌 、 头地霉 、顶 孢霉、链格孢 、郁金香葡萄孢 、枝状枝孢霉 、多主枝孢霉 、尖 镰孢 、宛氏 拟青霉、产黄青霉、指状青霉 、红色 发癣菌 、 Wallemia sebi、 Wangiella (Exophiala) dermatitisdis EORTC/MSG 2008 GM试验阳性 Probable invasive fungal disease 血清、血浆、 BAL、 CSF De Pauw B., et al., CID, 2008, 46:1813-21
