1、应用微生物学,Applied Microbiology,应用微生物学,概论微生物的生长微生物的代谢微生物的遗传与遗传育种微生物基因工程应用微生物的基因操作系统酶工程与生物转化微生物发酵微生物代谢工程,概 论,基本概念应用微生物学的发展微生物细胞的结构重要的应用微生物,定义,应用微生物学: 以一定的直接或间接应用目标研究微生物及其相互作用和与环境的作用的科学。(applied microbiology) 微生物学与相关的生物技术相结合，以实现一定的直接或间接应用目标。(microbiology in application),微生物的特点,资源量大（多样性丰富）生物量大（生长迅速）可塑性大（便于
2、操作）个体小（便于运输、携带）完成自然界的物质循环造福人类引起灾难,当前人类面临的问题,资源的压力环境的挑战传染病的新生与复发,微生物的应用部分,细胞基因基因产物（酶、蛋白质）代谢产物,应用微生物学需解决的问题,微生物菌种的获得和优化微生物培养条件的建立和优化微生物的应用,应用微生物学研究的一般流程,提出问题（工业、农业、环境、健康、国防） 微生物？ No Yes 菌种 解决问题 发酵 解决问题 应用 解决问题,应用微生物学的发展 微生物学的发展是与应用紧密联系的,逐步建立方法认识微生物 Leenwenhock (1673) 显微镜 Jenner (1798) 牛痘 Basteur (1860
3、s) 发酵、低温灭菌、自然发生 Koch (1881) 纯培养微生物形成产业 Fleming (1929) 青霉素 Waksman (1944) 链霉素 现代生物技术 Cohen (1972) DNA 重组,微生物细胞的结构,细胞壁形态保持、物质交换、信号识别细胞膜转运细胞质酶、反应场所细胞核遗传物质核外遗传物质线粒体、质粒,重要的应用微生物,病毒：-噬菌体细菌：大肠杆菌(E.coli) 棒杆菌(Corynebacterium)放线菌：链霉菌(Streptomyces)酵母菌：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)真菌：曲霉(Aspergillus),第一章 微生物的生长,
4、微生物生长的条件培养基生长动力学,微生物细胞的化学组成,细胞中几种主要元素的含量(干重的百分数),细胞干物质中主要组分和含量(%),微生物生长的条件物质条件,水 aw=P/P0,微生物生长的条件物质条件,碳源和氮源O H P S K Ca Mg FeMn Cu Zn Mo Co Ni V B Cl Na Si 维生素、氨基酸等,微生物生长的条件环境条件,pH 中性（弱酸、碱）、嗜酸、嗜碱温度 最适、生长、耐受氧气 严格（专性）好氧、兼性、耐氧厌氧、严格厌氧压力渗透压极端环境微生物 (extremophile)不可培养微生物 (VBNC vive but non-cultured),极端微生物与
5、不可培养微生物,极端环境微生物 (extremophile):依赖于一种或多种极端物化因子生存的微生物嗜热菌：50-80C (hyperthermophiles80C)嗜冷菌：9嗜盐菌： 3M嗜压菌不可培养微生物 (VBNC vive but non-cultured),培养基 提供微生物生长所需物质与环境条件的体系,培养基的组成要素,碳源、氮源、提供各种元素的无机盐生长因子或含生长因子的物质水、固化基（固体培养基）pH、渗透压（糖、盐浓度）、灭菌条件,培养基的种类,合成培养基 丰富培养基 特殊培养基,培养基的选择和设计原则,适用：利于达到目的 利于下游工艺 重复性好经济：原料价格 原料用量
6、全工艺综合平衡安全：环境影响 生物安全培养基的选择和设计是应用微生物学研究的重要内容,生长动力学,增值曲线（Multiplication curve）： 细胞数-时间生长曲线（growth curve）： 细胞量-时间,微生物生长的实验计量,显微计数菌落计数浊度测定细胞干重,微生物生长的数学描述,比生长速度(specific growth rate) = dx/xdt 细菌 0.6-1.2 酵母菌 0.3-0.5 放线菌 0.1-0.3 真菌 0.1-0.3 生物量倍增时间(biomass doubling time) td=ln2/ 增值度(multiplication degree) x/
7、xo,第二章 微生物的代谢,微生物初级代谢微生物次级代谢代谢调节,微生物的代谢,微生物细胞所进行的生化反应的总和物质代谢 细胞内及细胞与环境间的物质转换的过程能量代谢 载体信息代谢,微生物初级代谢,微生物从环境摄取物质、获得能量、合成自身新物质的过程 营养物 废弃物 能量（用于生长） 能量 合成代谢 （用于运动和物质转运） 细胞组分 酶 分解代谢 能量来源,重要的初级代谢途径,糖酵解途径 糖代谢的共同分解途径三羧酸循环 将糖最终氧化为二氧化碳和水，并产生大量能量磷酸戊糖途径 产生四碳糖、五碳糖和七碳糖等多种中间产物ED途径 细菌代谢葡萄糖产生乙醇的途径氨基酸合成途径,糖酵解途径(Embden-
8、Meyerhof pathway),GLC HXK ZWF SOL GND G6P G15L P6G RU5P PGI F6P PFKFBP F16P FBA GLYG3P DHAP GAP TPI TDH P13G PGK 3PG GPM 2PG ENO PEP PYK PDC ADH PYR ACA ETH,三羧酸循环(Krebs cycle),PYR ACoA MDH CIT MAL OAA CTT FUM ACO FUM ICI SDH OSM IDP SUC SUCC AKG LSC KGD,磷酸戊糖途径,氧化（产生NADPH ） RU5P P6G G15L G6P RKI RPE非
9、氧化 R5P X5P （分子重排 ） TKL TKL GAP S7P E4P TKL F6P,ED途径,存在于某些缺乏完整EMP途径的微生物中，是微生物特有的, 将2-酮-3脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）裂解为丙酮酸和3-磷酸甘油醛。,氨基酸合成途径,GLC 3PG Ser, Gly, Met （3磷酸甘油酸衍生型） PPP R5P PEP Phe, Try, Trp （芳香族氨基酸） His PRY Ala, Val, Leu （丙酮酸衍生型） OAA Asp ASA Lys（草酰乙酸衍生型） TCA Asn HS Thr AKG Met Ile Arg Glu Gln （酮戊二酸衍生型）
10、 Pro,微生物次级代谢,次级代谢是相对于初级代谢的概念，指微生物在一定的生长时期（一般为稳定期）以初级代谢物为前体、合成对微生物生命活动没有明确功能的物质的过程。 次级代谢（前体聚合、 初级代谢 结构修饰、装配）营养物 前体 次级代谢物 （初级代谢物）,次级代谢的生物学意义,次级代谢的生理意义目前尚无定论，但它肯定对微生物是有意义的，否则这种需要多种酶类协同参与、并在精细的调节机制控制之下的代谢过程是不会在生物体内保存下来的。维持初级代谢的平衡次级代谢产物作为储藏物质的一种形式使菌体在生存竞争中占优势与细胞分化有关,青霉素,S CH3R-CO-NH-HCCH C B A CH3 OC-N -
11、 CH COOH侧链： R-CO-母核：噻唑环 A ， -内酰胺环 B,青霉素的生物合成,代谢调节,细胞为维持正常的生理功能，它的组分、代谢物、能量和电子载体的合成大体上应保持恒定。当环境或细胞自身发生某种变化时，可以通过一定的反馈作用来达到平衡生长，这种反馈作用即代谢调节。,代谢调节的位点,DNA RNA 酶 底物 底物 产物 （营养物） （或中间物） 底物进入，酶的活性，酶的合成,代谢调节的本质：酶的调节,酶合成的调节：诱导与阻遏基因水平酶活性的调节：反馈抑制蛋白质水平,适应现象,例1，大肠杆菌乳糖代谢： 半乳糖苷酶 乳糖 -半乳糖 + 葡萄糖 E.coli生长于无乳糖培养基， 半乳糖苷酶
12、：3 分子/细胞 E.coli生长于含乳糖培养基， 半乳糖苷酶：3000-5000 分子/细胞例2，大肠杆菌色氨酸代谢： E.coli生长于无色氨酸培养基，合成色氨酸合成酶， 当色氨酸浓度增加时，色氨酸合成酶浓度下降。 细胞需要某种酶时才合成，反映出细胞的自我调节机理。这种诱导物诱导可诱导酶的产生与辅抑物抑制可阻遏酶的产生的现象称适应现象。 乳糖：诱导物(inducer) 色氨酸：辅抑物(corepressor),底物与诱导物,底物不等于诱导物,乳糖操纵子,i P O Z Y A 调节基因 i ：编码阻遏蛋白启动子 P ：有CAP(CAP与cAMP复合物)和RNase两个位点操纵基因 O：阻遏
13、蛋白结合位点结构基因 Lac Z： 半乳糖苷酶 Lac Y： 半乳糖苷透性酶 Lac A： 半乳糖苷转乙酰酶,协同诱导和顺序诱导,协同诱导 I a、b、c a b c顺序诱导 A B C D I a B b C c,操纵子(operon),I P O S1 S2 S3 调节基因 启动基因 操纵基因 结构基因 变构 (+ or -)外界信号调节蛋白I or CoR 操纵子：一组功能相关的基因共同组成的转录单位，它们结构上紧密联系、功能上协同表达，接受同一调控序列的调控。,诱导与阻遏,调节 调节蛋白活性 操纵子 结构基因 酶合成诱导 正 打开 表达 诱导 负 打开 表达 阻遏 正 关闭 不表达 阻
14、遏 负 关闭 不表达 ,反馈抑制,反馈抑制：在合成代谢途径中，代谢终产物抑制途径中第一个酶的作用。 E1 E2 E3 E4 A B C D E反馈抑制能对环境变化做出快速反应特点： 1，只有终产物或其结构类似物有反馈抑制 2，受抑制的是途径中的第一个酶 3，反馈抑制是可逆的,别构酶(allosteric enzyme),有多亚基和四级结构有结合底物的活性中心和结合调节物的别构中心活性中心和别构中心在酶分子的不同部位,分支生物合成途径的调节,P1 A B C P2协同反馈抑制同功酶反馈抑制累积反馈抑制顺序反馈抑制（细调）,协同反馈抑制,P1 A B C P2 合成代谢途径中的第一个酶有几个变构中
15、心，分别可与不同终产物结合，每一种终产物对第一个酶都没有反馈抑制作用，只有当几种终产物同时过量时才有反馈抑制作用。,同功酶反馈抑制,P1 A B C P2 合成代谢途径中的第一个酶有几种结构略有不同的同功酶，每一种终产物只对一种同功酶有反馈抑制作用，只有当几种终产物同时过量时，才使几种同功酶同时被作用而抑制合成反应。,积累反馈抑制,P1 A B C P2 每一种终产物对第一个酶都有一定的反馈抑制作用，他们合在一起达到最大程度的反馈抑制。,顺序反馈抑制,P1 A B C P2 合成代谢途径中的第一个酶的效应物不直接是终产物而是代谢分支点的中间物，每一种终产物抑制分支后的第一个酶，使分支点的中间物
16、积累，然后抑制合成代谢途径的第一个酶。 这一调节作用可根据不同终产物的量分别调节，是一种细调。 在许多分支代谢的调节中，细调与粗调往往同时发生。,第三章 微生物的遗传与菌种选育,微生物的遗传物质基因突变基因重组遗传育种,微生物的遗传物质,核酸(DNA RNA)染色体染色体外遗传物质,DNA是遗传物质的实验证明,肺炎双球菌转化 S - dead， S - alive， R - alive S dead - S - S R噬菌体感染 T2(DNA-32P,protein-35S) - E.coli -上清T2（ 35S ） 沉淀E.coli（ 32P ） 双螺旋模型,基因突变,遗传物质小范围的改变
17、，只涉及一对或少数几对碱基，又称点突变。,基因突变的类型,基因型 置换：GA, CT 转换( transition)；G,A C,T颠换(transversion) 移码(frameshift)：DNA分子中一对或几对核苷酸的增加或缺失表型 形态：造成形态发生改变的突变 致死：造成个体死亡或生活力下降（半致死）的突变 条件致死：在一定条件下有致死效应的突变 生化：没有形态效应的突变，如营养缺陷、抗药性等翻译 同义、错义、无义(UAG, UGA, UAA),基因突变的特性,稀有性 突变率低（可通过理化处理提高突变率）随机性独立性 Kmr 10-5, Apr 10-6, Kmr Apr 10-11
18、可逆性 回复突变率也很低稳定性突变率：一个世代或一定时间内发生突变的概率。,几种微生物每次复制的突变率,诱变剂,能引起微生物遗传物质发生改变的化学物理因子化学：碱基类似物（5-溴尿嘧啶、羟胺、亚硝酸） 烷化剂（亚硝基胍、硫酸二乙酯）物理：短波（紫外线） 射线（X-射线、射线）,诱变剂的作用,基因突变的应用-诱变育种,虽然分子生物学技术已普遍用于育种，诱变育种仍是重要而基本的育种方法。诱变育种的基本步骤： 出发株诱变剂处理初筛复筛鉴定 一般要进行多次，以积累有益突变。诱变谱系： 诱变剂处理1 诱变剂处理2出发株 中间株1 中间株2 目的株,诱变育种的关键环节,出发株：性状、潜力诱变处理：诱变剂选
19、择、剂量筛选：方法、筛选量High-throughput screening,致死率与诱变效果,突变株的筛选,初筛：弃去大量无价值菌株复筛：选出少数有价值菌株方法： 直接测定 利用可观察现象 营养限制培养基 选择培养基,组成型育种, 半乳糖苷酶加诱导酶抑制剂 培养基： 乳糖+邻硝基-D-岩藻糖苷（诱导型酶抑制剂） 只有组成型能利用乳糖交替培养法 培养基1：乳糖 培养基2：葡萄糖 交替培养使组成型优势扩大,交替培养法,营养缺陷型育种,营养缺陷型 C- A B C B 积累 A B C D 积累 D,抗反馈抑制育种,原理： 产物 + 酶（结合于调节中心） 反馈抑制 类似物+ 酶（结合于调节中心）
20、影响生长 抗类似物的变异株 类似物与酶的调节中心不能结合 产物与酶的调节中心不能结合 反馈抑制解除 产物能过量积累,抗反馈抑制育种举例,苏氨酸 C.crenatum AS 1.542 0 mg/ml MNNG LR-1458 AHVr 6mg/ml 1 MNNG LRA-96 AHVr 8mg/ml ,Met- 3.5 MNNG LRA-359 AHVr 10mg/ml ,Met- 6.5 LRA-359-66 7.0 DES D20-23 AHVr 20mg/ml ,Met- 9.0 m85 13.0,Asa Hse Thr Ile Met AHV(-氨基-羟基戊酸): Thr, Ile结构
21、类似物,抗底物类似物育种*,海因酶（二氢嘧啶酶） 5-氟尿嘧啶：底物(尿嘧啶)类似物，诱变剂 抗底物类似物 大量产生分解底物(类似物)的酶 培养剂：平板培养剂+ 5-氟尿嘧啶 UV NTG NTG+5-FU J43 J404 BO419 M39 0.275 0.714 1.34 4.32 IU/ml,产物压力法*,L乳酸 ADH 丙烯醇 烯醛（对细胞有毒性） NTG 丙烯醇 AS3.3461 HBF12（从21株中选出） 乳酸 68 96 乙醇 16 4 ADH 50 12,基因重组,基因重组是遗传物质大范围的改变，涉及一个或多个基因、部分染色体甚至整个基因组。有性生殖：与高等生物相同，限于产
22、有性孢子微生物细胞融合：通过原生质体结合：通过细胞间接触转导：通过噬菌体为媒介转化：游离DNA直接进入宿主细胞感染：病毒DNA进入细胞,细胞融合育种,溶菌酶 A+B- A+B- PEG A+B+ 再生 A+B+ 溶菌酶 (A-B-) (A-B-) A-B+ A-B+亲代细胞 原生质体 融合原生质体 融合子,菌种的保藏,菌种保藏方法 液体隔绝法 冷冻干燥法 低温保藏法菌种保藏中心 ATCC ( American Type Culture Collection) IFO (Institute for Fermentation, Osaka) CGMCC (China General Microbi
23、ological Culture Collection Centre) ACCC (China Agricultural Culture Collection Centre) CACC (China Antibiotic Culture Collection Centre) CICC (China Industrial Culture Collection Centre),第四章微生物基因工程,基本概念工具酶载体目的基因的获得DNA体外重组基因的转移工程菌的筛选,基因工程基本概念,名词： genetic engineering, DNA recombination, recombinant D
24、NA techniques , gene manipulation, gene cloning, molecular cloning基本材料： 供体，载体，受体一般过程： 基因 体外重组转入受体分离鉴定 载体,工具酶,限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶ITaq DNA聚合酶逆转录酶S1核酸酶碱性磷酸酯酶,限制与修饰,E.coli C .C EOP=1 EOP=1 EOP=1 EOP=10-4 .K E.coli K,限制性内切酶,一类专一性很强的核酸内切酶，包括对碱基的专一性和磷酸二酯键断裂方式的专一性。,限制性内切酶的命名与作用特点,命名：根据分离到该酶的菌株 例：Hind Hemop
25、hilus influenza d 作用特点： 1，识别46个核苷酸序列 2，中心对称 3，可产生粘性末端或平末端,几种限制性内切酶,限制酶的反应条件,Buffer NaCl Tris MgSO4 DTT L 0 10mM(pH7.4) 10mM 1mM M 50mM 10mM(pH7.4) 10mM 1mM H 100mM 50mM(pH7.4) 10mM 0 * 20mM KCl 10mM(pH8) 10mM 1mM第二活性 EcoR I 当甘油10% (1220)，Mn2+代替Mg2+, pH8.5时，识别AATT,DNA连接酶,3 5 -OH P- T4: ATP, Mg+2 ATP Ppi E.coli: NAD, Mg+2 E E-AMP E A P -H P- AMP -,
