1、用 SELDI 技 术 预 测 吉 非 替 尼 治 疗 肺 癌 疗 效 的 前 瞻 性 研 究 报 告 *谢莉 1 马小军 2 魏淑青 3 李琦 1 李波 3 裴毅 31.山西医科大学第二临床医学院，太原 0300012. 山西省大同市第五人民医院呼吸内科，大同 0370063. 山西省肿瘤医院老年病科，太原 030013摘要：目的 介绍 SELDI-TOF-MS 技术预测吉非替尼治疗肺癌疗效观察，探索新的用药指征。方法 应用CM10 弱阳离子芯片结合表面增强飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术检测 9 例晚期肺癌患者口服吉非替尼前血清样本的蛋白质谱，口服吉非替尼 1 个月后，根据实体
2、瘤近期疗效标准分为服药有效组（CR+PR）（4 例）和无效组（SD+PD ）（5 例），利用 Biomarker Wizard 软件比较各组间的血清蛋白质指纹图谱。结果 有效组与无效组相比有 4 个蛋白质峰有显著差异性，M/Z 分别为 4889，1576，1762 和8693，与无效组相比，有效组上调的峰为 2 个，其 M/Z 为 1576 和 1762，下调的峰为 2 个，其 M/Z 为4889 和 8693。结论 SELDI-TOF-MS 技术用于肺癌患者吉非替尼治疗前血清蛋白质质谱分析，可筛选出预测吉非替尼治疗疗效的相关蛋白质组指纹，此方法捕获的蛋白质组指纹，可作为一种选择用药的新指标。
3、其他抗肿瘤药物的预测也可由此效仿。关键词：SELDI-TOF-MS；吉非替尼；肺癌；疗效中图分类号：R393 文献标识码： A 文章编 号 ： 4912A report on the study of the estimation of the therapeutic effect in treatment of lung cancer with gefitinib by SELDI 研究报告吉非替尼的 SELDI 在肺癌治疗的效果Xie Li1, Ma Xiao-jun2, Weishuqing,3 Li Qi1, Li Bo3, PEI Yi31. The Second Affiliate
4、d Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan, 030001,Shan Xi, China2. Da Tong City Fifth Peoples Hospital, Da Tong, 037006, Shan Xi, China 3. Shan Xi Tumor Hospital, Taiyuan, 030013,Shan Xi, China*基金项目：山西省攻关课题，编号：2006031090-01作者简介：谢莉(1978-)，女，山西医科大学 2005 级硕士研究生，医师，主要研究方向：老年肿瘤，E-mail:，导师：裴毅教授通讯作者
5、：裴毅，山西省肿瘤医院老年病科，E-mail：，手机：13015470704Abstract：Objective Introduce a new technology on prediction of the therapeutic effect in treatment of 1ung cancer with Gefitinib, and a new indicator in application of anti-tumor drugs. Method The serum of 9 advance lung cancer were collected before application
6、of Gefitinib, and by SELDI-TOF-MS(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) technique and CM10 proteinchip, these serum proteomic fingerprints were memorized. According to the Response Evaluation Criteria In Solid Tumor(WHO,1979), 9 patients who had took Gefitini
7、b for 1 month were divided into 2 groups, efficacy group(4 cases, CR+PR) and inefficacy group(5 cases , SD+PD). The detected data were analyzed by Biomarker Wizard Software. Results There were 4 significant different protein fingerprints between efficacy and ineffiecacy group (M/Z values were 4889，1
8、576，1762 and 8693). Compared with inefficacy group,it was height that 2 protein fingerprints(M/Z values were 1576，1762) and it was lower that 2 protein fingerprints(M/Z values were 4889，8693) in efficacy group. Conclusion It may be a new indicator in estimation of the therapeutic effect of treating
9、of lung cancer with Gefitinib that the proteomic fingerprints were memorized before application of Gefitinib by SELDI-TOF-MS，and other anti-tumor drugs？！ Key words: SELDI-TOF-MS; Gefitinib:Lung cancer; Therapeutic effectChinese Library Classification (CLC): R393 Document code:A Article ID:4912吉非替尼目前
10、已成为治疗非小细胞肺癌主要的二、三线治疗药物 1，其疗效较稳定,副作用小，受到广大非小细胞肺癌患者的喜爱。尤其对于年龄大于 65 岁的老年非小细胞肺癌患者，其已成为一线治疗药物。目前该药应用的适应症虽然在不断扩展，众多研究结果均显示吉非替尼对肺腺癌，女性，非吸烟者更有效 2-3，但该药治疗非小细胞肺癌的用药适应症仍不明确。我们课题组在行蛋白质组学的系统研究中，采用 SELDI 技术对吉非替尼治疗非小细胞肺癌的疗效进行了有意义的探索性的前瞻研究，发现 SELDI 技术有可能预测吉非替尼疗效，可以作为新的吉非替尼用药指征，用于临床抗肿瘤治疗，现报告如下。1 对象与方法1.1 入组标准经组织病理学或
11、细胞学确诊的晚期肺癌； 年龄18岁；放疗和(或) 化疗失败者； 至少有一个可测量病灶； 血常规及生化检查基本正常；无重要脏器功能衰竭；患者的生存预期应大于3个月。1.2 临床资料2004年4月-2007年10月在我科住院患者 9例，男性2例，女性7例；中位年龄70岁(37-76岁)；均为 期患者；吸烟者 3例，不吸烟者6例；腺癌5例，鳞癌1例，腺鳞癌1例,小细胞肺癌2例，骨转移3例，脑转移1例，肝转移1例，肺内转移1例；KPS80分者7例，70分者2例。1.3 实验工作1.3.1 标本采集首次口服吉非替尼治疗前，清晨空腹末梢静脉血 3 ml（不抗凝），静置， 3000 转/分，离心 5 分钟分
12、离血清，-80 低温冰箱保存（备用）。1.3.2 主要仪器、软件及试剂PBS-c 表面增强飞行时间质谱仪（SELDI-TOF-MS）、能量吸收分子 EMA ,CM10 型蛋白质芯片及相应分析软件 ProteinChip 3.2.0、Biomarker Wizard (美国 Ciphergen 公司) ，HFPFS 缓冲盐(Sigma 公司) ，CHAPS 缓冲盐(Sigma 公司) 。1.3.3 实验方法（1）血清样本处理：血清标本冰浴解冻，10000 r/min 离心 2 min。取血清样品 5 ul , 加 10 ul 9 M 尿素。振荡 30min，加 180 ul 缓冲液稀释（100
13、mmol/L NaOAc pH 4.0） ，4 10000 r/min 离心 2 min，取上清待用。（2） 芯片处理：将芯片放入盛有 100 mmol/L 盐酸的试管中，振荡 45 min，HPLC水冲洗，将芯片安装到 Bioprocessor 上，每孔加 200 ul 结合缓冲液，室温振荡 5 min，弃掉液体，重复一次。每孔上样 100 ul 已处理好的血清样品，室温振荡 1 h。弃掉液体，用 200 ul 结合缓冲液（100 mmol/L NaOAc pH4.0）洗 2 次，每次 5 min，拆下芯片，待芯片自然干燥，然后每点加 SPA 0.5 ul , 两次。干燥，用 CM10 蛋白
14、芯片阅读仪读芯片。SPA=Sinapinic acid 为 CAN（乙腈）50 % 和 TFA（三氟乙酸）0.5 %的饱和溶液（3）数据收集：设定检样激光强度 195，检测灵敏度 8，收集数据质荷比（M/Z）范围 1.02.0 KD。收集位置 2080。平均每点收集 20 次，收集总点数是 140 次。在每次实验数据收集前，用 All-in-one 蛋白芯片校正仪器，使之误差0.1 %。以质量控制蛋白质芯片做重复性检测，其峰值的大小及其强度的变异系数（CV S）均控制在 0.05 %和 15 %以下，具有良好的重复性。1.4 治疗方法所有患者均停用化疗和其他抗癌治疗，口服吉非替尼，每日250
15、mg，一天一次。治疗期间如有可观察肿块增大或毒副作用不能耐受时中止用药。服药前及服药后一个月开始常规血液学检查，针对可观察肿瘤影像学每12个月检查一次。1.5 分析方法1.5.1 疗效评价标准肿瘤病灶疗效评价标准采用WHO实体肿瘤疗效评价标准 4，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR) 、稳定(SD)和进展(PD)。疗效于服药28后天评定，CR和PR 在首次评价4周后进行疗效确认。1.5.2 分组方法根据WHO实体肿瘤疗效评价标准分为口服吉非替尼有效组（CR+PR）和无效组（SD+PD）。1.5.3 实验结果的统计学处理用 Biomarker Wizard 3.1 软件比较二组血清蛋白质指纹图
16、谱数据，寻找二组之间表达有差异的蛋白质峰，用 Biomarker Wizard 软件分析计算比较二组中相同质荷比的蛋白质含量(丰度)的 P 值（p0.05 认为有统计学意义）。2 结果2.1 分组实验结果2.1.1 用SELDI技术描述的9例患者的蛋白质组指纹（见图1）（a） （b）图1 9例患者的蛋白质质谱图Fig. 1 The serum proteomice fingeprints of 9 lung cancer before application of Gefitinib口服吉非替尼有效组（effiecacy group）口服吉非替尼无效组（ineffiecacy group）注：
17、横坐标为M/Z（相对分子量)，纵坐标为蛋白质的相对丰度，（a）为质谱图、（b）为模拟电泳图Note: X: M/Z(relative molecular weight) Y: Relative abundance of protein (a): The serum proteomice fingeprints (b): Simulated electropherogram2.1.2 不同分组中吸烟、性别、肿瘤病理结构有效组中吸烟者2例，肺腺癌3例，肺鳞癌1例，女性3例，男性1例；无效组中吸烟者1例，肺腺癌2例，小细胞肺癌2例，肺腺鳞癌1例，女性4例，男性1例。2.2 近期疗效9例患者均可评价疗
18、效，完全缓解0例，部分缓解4例(44.4 ) ，稳定2例(22.2 )，进展3例(33.4 )包括2例小细胞肺癌。有效率为(CR+PR)44.4 。2.2.1 应用 Biomarker Wizard 软件对有效组和无效组血清特异性蛋白质质谱图比较，在检测出的 88 个蛋白质峰中，其中有 4 个差异蛋白质峰有统计学意义(P0.05，见表 1)。 无效组（ineffiecacy group）有效组（effiecacy group）M/ZMean SD Mean SDP4889 2.02 1.65 0.38 0.21 0.0141575 1.31 0.57 3.3 1.68 0.0271762 1.
19、36 0.86 4.66 2.43 0.0278693 13.62 3.57 7.3 2.19 0.027表 1 吉非替尼治疗有效组与无效组指纹丰度比较 N=9Table 1 The comparision of protein abundance between efficacy group and inefficacy group with Gefitinib N=9表中可以看到 M/Z 为 4889， 1575，1762，8693 的蛋白质组指纹（丰度）在有效组，无效组之间有显著差异。其中与无效组相比，有效组上调的峰为 2 个，其 M/Z 为1576（图 2）和 1762（图 3） ，下
20、调的峰为 2 个，其 M/Z 为 8693(图 4)和 4889 (图 5) 。(c) (d)图 2 M/Z 为 1576 的蛋白质峰Fig. 2 The protein peak whose M/Z is 1576注：横坐标为 M/Z（相对分子量)，纵坐标为蛋白质的相对丰度，（c）为质谱图、（d）为模拟电泳图，可见该蛋白质指纹在有效组中表达高于无效组。无效组（ineffiecacy group）有效组（effiecacy group）Note: X: M/Z(relative molecular weight) Y: Relative abundance of protein (c): Th
21、e serum proteomice fingeprints (d): Simulated electropherogram Compared with inefficacy group, the protein fingerprint was height in efficacy group.（e ） (f) 图 3 M/Z 为 1762 的蛋白质峰Fig. 3 The protein peak whose M/Z is 1762注：横坐标为 M/Z（相对分子量)，纵坐标为蛋白质的相对丰度，（e）为质谱图、（f）为模拟电泳图，可见该蛋白质指纹在有效组中表达高于无效组。Note: X: M/Z
22、(relative molecular weight) Y: Relative abundance of protein (e): The serum proteomice fingeprints (f): Simulated electropherogram Compared with inefficacy group, the protein fingerprint was height in efficacy group.(g) (h)图 4 M/Z 为 8693 的蛋白质峰Fig. 4 The protein peak whose M/Z is 8693注：横坐标为M/Z(相对分子量)
23、，纵坐标为蛋白质的相对丰度，（g）为质谱图、（h）为模拟电泳图，可见该蛋白质指纹在有效组中表达低于无效组。Note: X: M/Z(relative molecular weight) Y: Relative abundance of protein (g): The serum proteomice fingeprints (h): Simulated electropherogram Compared with inefficacy group, the protein fingerprint was lower in efficacy group.（i） (j)有效组（effiecacy
24、 group）无效组（ineffiecacy group）有效组（effiecacy group）无效组（ineffiecacy group）有效组（effiecacy group）无效组（ineffiecacy group）图 5 M/Z 为 4889 的蛋白质峰Fig. 5 The protein peak whose M/Z is 4889注：横坐标为M/Z(相对分子量)，纵坐标为蛋白质的相对丰度，（i）为质谱图、（j）为模拟电泳图，可见该蛋白质指纹在有效组中表达低于无效组。Note: X: M/Z(relative molecular weight) Y: Relative abund
25、ance of protein (i):The serum proteomice fingeprints (j): Simulated electropherogram Compared with inefficacy group, the protein fingerprint was lower in efficacy group.3 讨论肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，绝大多数肺癌患者初诊时已属中晚期，尽管近年来手术化学治疗和放射治疗有了很大的进步，但患者长期生存率并未得到明显提高。因此，迫切需要探讨新的有效的治疗措施，新型靶向制剂表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼成为我们关注的热
26、点。但临床研究显示，吉非替尼对非小细胞肺癌的疗效各不相同。因此，探寻新的吉非替尼治疗肺癌的用药适应症，以获得最大疗效的研究已成为迫切需要。SELDI（Surface-enhanced laser desorption/ionization）技术的全称是 SELDI-TOF-MS，即表面增强激光解析离子飞行时间（time of flight）质谱技术，其结果是用 MS（质谱计mass spectrometer）在一焦平面上，按被检物质的质荷比（ M/Z）大小，顺次记录其含量的大小（丰度）进行描述。是赛弗吉（Ciphergen）公司新近推出的一种集合系列型蛋白质芯片（Proteinchip ）和激
27、光解析电离质谱技术相结合的检测体液技术的蛋白质分析平台蛋白指纹仪。其最大特征是用一组称为 Proteinchip 的蛋白质芯片，在检测前根据不同的蛋白质与芯片内容结合方式的不同就将被检的蛋白质大致分类，进行初筛。因此这种方法简单、易行、准确、分析简化，本研究采用的是 CM10 芯片，其活性表面由弱羧基阴离子构成，通过离子亲和作用与蛋白质分子中带有正电荷的赖氨酸、精氨酸、组氨酸等氨基酸残基结合。在蛋白质结合区的周围有疏水涂层，使得蛋白质与芯片结合更均匀。因此用其捕捉带正电荷的多肽和蛋白质、尤其是未知蛋白质几率较大。该技术曾获 2002 年诺贝尔化学奖，最大特点是具有快速、准确、高效、简单、大量捕
28、获未知蛋白质功能，并以指纹图（峰型及丰度）准确描述和量化。重复性较好是其优点的具体表现。现代的药学理论认为耐药的发生与机体的某种蛋白质存在与否有决定的关系，如 P-糖蛋白等足以说明这一切。尽管有原发性耐药和继发性耐药的区别，但仍与蛋白质有关，由于参与耐药的蛋白质很多，且各种药物都有各自特异的耐药蛋白，所以现行的蛋白质分析方法完全认定这些蛋白质是非常困难的。由于 SELDI 技术 具有快速、准确、高效、简单、大量捕获未知蛋白质功能，所以有可能利用其特点海量捕获对某种药物耐药有关的且尚不了解的蛋白质组指纹，以此作为筛选标准。因此研究工作以已知疗效的患者血清为研究对象，描述其蛋白质组指纹，用 Bio
29、marker Wizard 软件分析有效组和无效组有显著差异的指纹（峰型及丰度）并进行比较，以期探索 SELDI 技术能否预测吉非替尼治疗非小细胞肺癌的疗效。图 1 的结果描述了研究对象的基本情况，其中有效者 4 人，无效者 5 人包括 2 例小细胞肺癌。表 1 和图 2、3、4、5 结果描述了本研究的工作，其结果表明有效组和无效组的蛋白质组指纹，其 M/Z 为 4889，1576，1762，8693 的蛋白质指纹在二组间的确存在有明显差异，有效组与无效组相比，M/Z 为 4889 和 8693 蛋白质在有效组中呈现低表达，而 M/Z为 1576 和 1762 的蛋白质在有效组中呈现高表达。由
30、于本工作是探索性研究，设计工作以直观为主，首先突出阳性结果，因此在疗效分组上，因稳定患者较少而归于无效组，因例数少，没按病理分组，这些将会对指纹比较带来一定的偏差，但作为有效和无效的区分，则获得了明确的结果，从临床意义来讲，获得了肯定的结论。因此，从本研究的结果看，采用 SELDI 技术可以预测吉非替尼的临床疗效，例数较少是本研究的唯一不足，应加大例数行验证实验，总体来看，采用蛋白质组指纹技术，海量捕获未知或已知的耐药蛋白质，不失为一种指导临床抗肿瘤药用药指征选择的新方法，极具有推广价值。参考文献：1管中震,张力,李龙芸,等.吉非替尼治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌在中国的临床研究 J.癌症,
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33、2005, 10 suppl 2:23-29.4Therasse P, Arbuck SG, Eisenhauer EA, et al. New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors.European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, Nationl Cancer Institute of CanadaJ.J Natl Cancer Inst,2000, 92:205-216.
