1、 研究生学位论文选题报告研 究 课 题 毛细管电泳电化学发光在抗肿瘤药物中的研究与应用研 究 生 姓 名 徐 泉 秀 所在教研室名称 分析教研室 攻 读 学 位 硕士研究生 导 师 姓名职称 邓必阳教授 论 文 工 作 的起 止 时 间 2007 年 9 月至 2009 年 1 月 桂 林 工 学 院 研 究 生 处 制一、 选题依据（选题来源，研究意义，国内外研究现状、水平和发展趋势）（1）选题来源：课题来源于国家自然科学基金和广西自然科学基金。（2）研究意义：随着我国人口老年化及环境的恶劣变化，患肿瘤的病人越来越多，因此社会对治疗肿瘤病的药的需求在不断的扩大和更新，所以肿瘤药物分析在临床、
2、药代动力学及药物开发研究中具有重要地位，随着肿瘤药物分析的不断发展，它不但要求分析结果准确可靠，而且要求分析方法简单快速，尤其是对痕量和微量药物分析。将毛细管电泳(CE)分离-电致化学发光(ECL)检测联用是近年来发展的一种新方法 (简称 CE-ECL)。该法不仅具有 CE 的快速高效分离、样品用量少等特点，又发挥了 ECL 高选择性、高灵敏的优点,因此有良好的药物分析和临床分析应用价值。CE-ECL 联用技术作为一种高效、快速、灵敏的分析方法恰好能满足上述要求，将其用于肿瘤药物分析不仅具有理论意义，而且还有重要的实用价值。在优化的条件下，三联吡啶钌 CE-ECL 分离检测体系体现了选择性好、
3、灵敏度高、重现性好、分析时间短、线性关系好等优良性能。应用该方法在 几分钟内可成功地测定代谢液中的抗肿瘤药物，该技术可以作为定量分析代谢液中抗肿瘤药物的有力工具。（3）国内外研究现状、水平和发展趋势：毛细管电泳（CE） ，是近年来发展最快的新兴研究领域之一，泛指在极细的毛细管内实现的一类电泳技术。与传统电泳相比，根本区别在于它使电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行，从而确保引入高的电场强度，全面改善分离质量。最早提出毛细管电泳构想的首推瑞典科学家 Hjerten，他于 1967 年的一篇论文中最先提出了一种以内壁有甲基纤维涂层，内径为 3mm 的石英玻璃管为分离通道的高电场分离方法，这就是毛细
4、管电泳的雏形。Mikkers 等（1979）用内径为 200m 的 PTFE 管，以区带电泳模式分离了 16 种有机酸，获得了小于 10m 板高的电泳分离效率，为毛细管电泳研究做了开创性的工作，只可惜没有引起当时分离科学界的足够重视。Jorgenson（1981）在 75m 内径的毛细管内用高电压成功分离了多种丹酰化氨基酸并得到了前所未有的高达400000/m 的理论塔板数，他们的理论工作进一步指出，在考虑分子扩散为区带增宽的唯一因素时，生物大分子的分离会在短时间内获得惊人的效率。正是他们出色的实验和理论工作轰动了分离科学界的发展，成为 CE 历史上划时代的里程碑。Hjerten 等（1983
5、）提出了毛细管凝胶电泳（CGE） 。Terabe 等（1984）发展了毛细管胶束电动色谱(MECC)。Hjerten（1985）建立了毛细管等电聚焦电泳(CIEF)，多种分离模式的提出扩大了 CE 的应用范围。1988-1989 年间，具有在线检测和自动进样功能的 CE 仪器开始推向市场，CE 定量分析性能得到显著提高，逐步成为各学科实验室中一种有力的分析手段，使其在无机离子、有机分子、药物、临床物质分离分析中得到广泛的应用，并逐渐应用于生命科学 DNA 测序、蛋白质、多肽、核苷酸和氨基酸等生物分子的分离分析。20 世纪 70 年代，有关电化学发光（ECL）在分析科学中应用的文献报道较少，80
6、 年代初期开始逐渐增多，其中包括 ECL 流通池和探针的设计、ECL 与流动注射分析、高效液相色谱以及毛细管电泳等微型分析系统的联用。目前在分析科学中 ECL 主要用于被测物含量的分析，另外，ECL 作为一个电化学过程，可以被用作研究电化学过程的工具，还可以作为诊断工具研究电极表面条件，用于表面化学研究，特别是研究组装、吸附化合物膜的性质，利用 ECL 聚合物制作发光器件，利用 ECL 影像技术研究聚合物在电极表面沉积、涂覆后的多相性和覆盖度，研究电化学和电化学机理以及表面相互作用。在电极总电流无法区分的条件下，ECL 也可以用来确认电极上发生众多反应中的某个反应。而三联吡啶钌(Ru(bpy)
7、 3 2+)是目前研究最多和应用较广泛的一种化合物。由于 Ru(bpy)32+ ECL 具有很多优点，成为几个 ECL 体系在实际分析中应用最多的化合物，Ru(bpy) 3 2+ECL 作为一种检测方法，常用于 FIA，HPLC 等流动体系检测物质含量，可检测草酸盐以及含氮的物质；与一些可利用 -烟酰氨腺嘌呤辅酶将 NAD+ 转化为 NADH 的一些脱氢酶组合在一起，可用于分析一些生化样品。Fahnrich（2001）总结了电化学发光在分析化学中的应用，例如将Ru(bpy)32+、NAD+ 和酶一起固定在电极的表面可制成不消耗试剂的脱氢酶Ru(bpy)32+ ECL 生物传感器。非放射性的含
8、Ru 的 ECL 标记物已经在 ECL 免疫和 DNA 探针分析中得到很多应用，并有商品化的仪器出售。这类标记物安全、灵敏、响应线性范围宽、仪器简单、保存期长、成本低，比 luminol 系列标记物有更好的应用价值，Ru(bpy)3 /TPA ECL 反应体系可检测这种 ECL 标记物。Bard 小组在 Ru(bpy)32+ECL 领域的研究工作一直处于领先位置，他们开展了大量的该体系的机理及应用研究。近几年，ECL 技术逐渐应用于 CE，简称 CE-ECL，最早报道的工作是 Ewing 小组，Ewing 等（1994）将 luminol ECL 反应用于 CE 分离检测，被测物为辛胺、丙胺以
9、及三肽 Val-Tyr-Val，CE 分离前用 ABEI-DSC 衍生。Ru(bpy)32+ CE-ECL 是近年来发展最迅速、最有影响的分离分析手段之一，其具有检测限低、分离速度快、效率高、取样体积小（110nL） 、溶剂消耗少和样品预处理简单等优点。由于其不但可以检测阴、阳离子，更主要的是它可以检测大分子量的有机质（物） ，因此，在分析化学、医药学、生命科学等各领域具有广泛的应用，也越来越多地用于实际样品的分离和分析工作。我国关于 Ru(bpy)32+ CE-ECL 的研究虽然刚刚起步，但长春应用化学研究所汪尔康小组在这方面开展了大量的工作，自行设计了 ECL 仪、CE-ECL 仪，并将此
10、技术应用于含氮药物的分析，在动物实验的基础上又进一步将这种技术应用于临床分析，检测了病人体液中的药物含量，实验证明 CE-ECL 技术对于药物临床分析具有很好的应用价值。其 CE-ECL 检测仪的性能处于国内外领先的地位，其小组在国际刊物上发表了一系列论文。可以预言 CE-ECL 仪器和分析技术将成为推动生命科学发展的动力，带来巨大的社会和经济效益。二、研究目标、内容及拟解决的关键技术问题（1）研究目标：针对毛细管电泳常采用的吸收检测方式中因为测量的光程短，检测灵敏度较低以及生物体内药物浓度本身很低，常规的紫外吸收检测不适用的问题，我们建立了毛细管电泳-化学发光检测在线联用体系。将该方法用于具
11、有化学发光响应的药物制剂及药物在生物体内的代谢物进行了分析，为药物的分析提供灵敏的检测手段。并且由于化学发光检测的选择性，在选定的化学发光体系下，可以减小甚至避免血液中内源性物质对分析检测的干扰，使本方法对于样品的的要求较低，简化了样品预处理步骤。快速分析抗肿瘤药物在临床上的应用，对了解它的疗效,、研究病人的药物代谢过程是很重要的。基于毛细管电泳电化学发光技术，本文阐述了一种检测抗肿瘤药物的新方法，对各种影响分离和检测的条件进行了细致研究光信号的物质的干扰。在优化的条件下，三联吡啶钌 CE-ECL 分离检测体系体现了选择性好、灵敏度高、重现性好、分析时间短、线性关系好等优良性能。应用该方法在
12、几分钟内可成功地测定代谢液中的抗肿瘤药物，该技术可以作为定量分析代谢尿液中抗肿瘤药物的有力工具。体内药物分析的手段 1光谱法：光谱法中包括比色法、紫外-可见分光光度法和荧光法。前两种方法的缺点是灵敏度不高，由于受体内内源性物质的干扰使分析结果可进行分析，但是步骤也比较繁琐。2免疫分析法：免疫分析法的原理是利用抗原-抗体特异反应进行分析，在生化检验中应用广泛。3色谱及手性色谱法：色谱法中有气相色谱（gas chromatography,GC）和液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC） ，气相色谱由于分析对象受限，应用的范围不如液相色谱普
13、及。液相色谱是目前应用较多，使用范围广，分析效率高的一种分析技术。但它对样品的要求比较高，样品的预处理步骤比较复杂，分析的时间也比较长，并不是所有的药物都适用。4毛细管电泳以及这些方法的联用：具有高分离效率的毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）的出现，为体内药物的分析提供了一条新的道路，相对于 HPLC，CE 的优点是能分析速度更快，样品需要量更少，对样品的预处理要求更低。相比较于 HPLC 的使用，在分析新鲜的、存在时间较短的药物代谢物上有明显的优势。（2）研究内容：将毛细管电泳技术与三联吡啶钌（Ru(bpy) 3 2+）电化学发光检测方法相结合，分析抗肿
14、瘤药物中的活性成分。具体开展如下研究：1、利用 CE-ECL 测定组织中丝裂霉素 C 的浓度2、利用 CE-ECL 分离测定长春质碱 3、利用 CE-ECL 进行测定枸橼酸他莫昔芬药代动力学方面的研究（3）技术方案（技术路线，技术措施）：取样：采集病人注射上述药物后的血液。样品处理：肝素抗凝，离心分离血浆。溶液配制：配制不同浓度的检测样品及不同PH值缓冲液。调试仪器：，先后用0.1mol/lNaOH溶液、亚沸水和缓冲液冲洗毛细管，注入三联吡啶钌发光试剂于发光池，用缓冲液调试MPI-B型多参数化学分析测试系统仪器。检测：；用配制好的溶液检测，从检测电位对电化学发光强度的影响，检测池缓冲溶液pH值
15、对电化学发光强度的影响，电泳缓冲液 pH值和浓度对电化学发光强度的影响，分离电压对电化学发光强度的影响入手，寻找出峰最好的条件。 （4）实施方案所需的条件（技术条件，试验条件）：本人已阅读了有关这方面的国内外的文献，实验仪器已熟练掌握，实验药品基本准备齐全。实验主要仪器：MPI-B 型多参数化学分析测试系统（西安瑞迈分析仪器有限责任公司，中国科学院长春应用化学研究所） ，超声波清洗器，石英亚沸高纯水蒸馏器，pHSJ-4A pH 计，微量可调移液器（5）存在的主要问题和拟解决的技术关键：检测技术的关键在于如何设计电致化学发光池既能保证电致化学发光高灵敏度,又能有效消除毛细管电泳高压电场对电致化学
16、发光过程的影响。设计中需要考虑以下因素，如何消除毛细管电泳高电场对电致化学发光过程的影响，如何提供联吡啶钌试剂，如何有效提高电致化学发光的检测效率。有两个因素影响电致化学发光检测效率：一、是电化学过程,即保证分析物和联吡啶钌在电极表面充分接触发生电化学反应；二是光检测效率。因此,将毛细管末端和工作电极相对,光电倍增管从下面采集产生的光信号,整个发光池放在暗盒内,光的损失很小,保证了光检检测效率，通过离散小波变换降低基线噪音也可以改善方法检出限。三、可行性分析本人已阅读了有关这方面的国内外的文献，根据文献中关于 Ru(bpy)32+电化学发光机理的研究：胺类物质，特别是叔胺物质都能与 Ru(bp
17、y)32+ 发生反应，增强 Ru(bpy)32+ 的电化学发光强度。而我选择的抗肿瘤药物（丝裂霉素C、长春质碱、枸橼酸他莫昔芬）都具有叔胺基团，都能与 Ru(bpy)32+ 发生反应，增强 Ru(bpy)32+ 的电化学发光强度。而且用于 Ru(bpy)32+电化学发光试剂要求水溶性好的药物，这样就可避免干扰，我选的这几种药物水溶性都很好，用这检测方法应该是可行的。在本工作中，所有的实验主要是在 MPI-B 型毛细管电泳电化学发光检测仪（西安瑞迈电子科技有限公司）上完成的。该检测仪由四部分组成：数控电化学恒电位仪，数控毛细管电泳高压电源，多功能化学发光检测仪和多通道数据采集分析仪。电化学发光强
18、度的输出信号由计算机记录并放大。本实验采用柱端 CE-ECL 检测池，既可作静态池使用，也可作流动池使用。这种检测池采用较大直径的盘电极，大于或等于 300 m，由于直径较大，与分离毛细管外径尺寸 360 m 相当，因此使用普通的光学显微镜即可以准确地调节工作电极与毛细管准直，使得毛细管更换和安装方便。工作电极与毛细管出口界面之间的最佳距离根据检测信号强度调节。三电极体系包括直径 500 m 的 Pt 盘工作电极)，直径 1 mmPt 丝对极和直径 300 m 的 Ag/AgCl 参比电极(饱和 KCl)。300 L 5 mmol/L Ru(bpy)3 2+和 100 mmol/L磷酸盐缓冲液
19、混合溶液加入溶液池中，将电化学发光检测池放入发光检测仪的暗盒中，使透光窗正对光电倍增管(偏置电压-900V)。毛细管进样端放入缓冲液中，施加电泳电压，打开电化学分析仪和发光分析仪，待发光信号基线稳定之后(10s)电动进样，分离检测。还有超声波清洗器，石英亚沸高纯水蒸馏器，pHSJ-4A pH 计，微量可调移液器等仪器，实验仪器已熟练掌握，实验药品基本准备齐全。四、研究的创新点目前，还未见国内外有关用毛细管电泳电致化学发光法联用技术检测我所选的抗肿瘤药物（丝裂霉素、长春质碱、枸橼酸他莫昔芬） ，但是很多用的是高效液相色谱检测过这几种药物在体内的代谢过程，所以本人借鉴他人用的其他方法检测手段运用到
20、我的检测方法中，首次建立了用毛细管电泳-电致化学发光分离检测上述抗肿瘤药物的新方法。五、主要参考文献目录1Xue-Bo Yin,Erkang Wang，Capillary electrophoresis coupling with electrochemiluminescence detection:a review,Analytica Chimica Acta,2005,533:113120.2. Xue-Bo Yin, Shaojun Dong, Erkang Wang,Analytical applications of the electrochemiluminescence of t
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