1、第六节抗肿瘤药物体外研究方法,用体外细胞作抗癌药筛选具有用药量少, 周期短, 费用低等优点。体外筛选结果与体内试验的相关性好, 因此, 抗癌药体外筛选已作为常规的抗癌药初筛手段。,体外研究方法,然而,体外研究方法也有一定局限性，主要是体内环境极为复杂，与体外实验环境有很大差别，体外筛选的最大缺点是无法获得药物对组织选择性方面的资料。此外, 有些药物须在体内代谢活化 (如环磷酰胺)或通过机体反应(生物调节剂)才能对肿瘤细胞起作用, 因而不能通过体外筛选寻找。,体外研究方法,目前世界上已建立了很多体外肿瘤细胞系(株)。药物筛选应选用生长特性稳定, 增殖快, 对已知抗癌药敏感的细胞系。小鼠与人的瘤细
2、胞系对药物的反应大致相同, 前者具有在体内外均可进行试验的优点, 故较常应用。,体外研究方法,观察药物对肿瘤细胞体外生长的抑制作用，可选择1015种以上肿瘤细胞系(株)进行体外研究，受试药用5个或5个以上不同浓度，观察药物对细胞形态、细胞存活、细胞膜功能、生长曲线、克隆形成能力等指标的影响。每项指标各有其优缺点，因此，应根据实际情况将几项指标组合起来应用。,体外研究方法,一、体外培养肿瘤细胞的生长和增殖特性细胞生长是指细胞体积的增大，细胞增殖是指细胞数目的增多。体外培养的细胞生长增殖到一定密度时，则需进行传代(passage)。细胞每传一代后，一般要经历潜伏期、对数生长期和停滞期(平台期)3个
3、阶段。,体外研究方法,* 在指数生长期，取细胞数的对数与培养时间作图，可得一条斜率向上的直线，故也称此期为对数生长期，约35 d,体外培养的肿瘤细胞按其生长方式可分为贴附生长型和悬浮生长型两大类:贴附生长型: 细胞在培养时能贴附在支持物表面生长，有时也称为贴壁生长。,体外研究方法,悬浮生长型: 细胞在体外培养时不需要附着于支持物而在悬浮状态下生长，如取自血、脾或骨髓的培养细胞、血白细胞等。,二、MTT法() 基本原理 MTT是一种溴化四氮唑, FW:414.3, 是能接受氢原子的染料。 MTT可进入细胞内，活细胞线粒体中脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲臢, 而死细胞则无此
4、功能。甲臢的生成量通常与活细胞数成正比, 在一定波长下用酶标仪测定吸光度值(A), 即可定量测出细胞的存活率。,MTT,试剂与器材1.MTT溶液 用生理盐水或PBS配制成5 mg/ml贮存液，在磁力搅拌机上搅拌30min使之完全溶解。用前通过0.22m滤膜除菌和沉淀物，4避光保存，两周内有效。呈黄色,无沉淀。暂时不用，可冻存。2.含10%胎牛血清RPMI1640培养液，不含酚红指示剂；0.25%胰酶消化液；DMSO原液（分析纯）,作为甲臢的溶解液。,MTT,试剂与器材3. 96孔培养板(用新的）,血细胞计数板，微量移液器，微型振荡器，CO2培养箱，倒置显微镜，酶标仪。,MTT,操作步骤1.选用
5、对数生长期的贴附肿瘤细胞0.25%胰酶消化悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液(完全培养液)吹打成细胞悬液。2.用台盼蓝拒染法检测,活细胞应在97%以上。若是悬浮生长细胞, 可直接用台盼蓝排染法计数活细胞。,MTT,3.96孔培养板每孔加入细胞悬液190l，每孔含500040000个细胞(根据细胞的类型而定)。接种后，37、5%CO2预培养24h。4.将受试药物配成终浓度的20倍。受试药可用DMSO、培养液或生理盐水溶解。可设57个浓度组。,MTT,5.加药组每孔加入10l药液。因接种的细胞悬液体积为190l，又加入了10l药液，因此药液被稀释了20倍，等于所需要的终浓度。每组设35
6、个平行孔,最好5个。6.细胞在37、5%CO2培养箱中连续培养48h。然后每孔加入5mg/ml的MTT溶液10l，继续培养4h。,MTT,7.小心吸弃孔内上清液(若为悬浮培养的细胞，需1000r/min离心5min后再吸弃上清)。每孔加入150l DMSO，微型振荡器上振荡约10min，使甲臢结晶完全溶解。,MTT,96孔板用离心机,8.设置对照组 ： 空白对照孔(调零孔)：培养液、MTT和DMSO。 实验对照组：细胞、相同浓度溶解药物的溶剂培养液、MTT和DMSO。 加药组 ：细胞、受试药物、培养液、MTT和DMSO. 阳性药对照组: 操作步骤同加药组。,MTT,9.用酶标仪在570nm波长
7、测定每孔的A值(参考比波长450nm)。测定时以空白对照孔调零。应尽快完成测定。,MTT,结果评定 按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：实验对照组平均A值加药组平均A值 肿瘤细胞生长抑制率(%) 100%实验对照组平均A值,MTT,以不同浓度药物对肿瘤细胞生长抑制率作图，可得到剂量反应曲线, 从中求出该样品的半数抑制浓度IC50.,MTT,评价本方法已广泛用于抗肿瘤药物筛选、一些生物活性因子的活性检测、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。该方法的特点是灵敏度高、重复性好、经济、操作简便、易实现自动化、无放射性污染，且与其他检测细胞存活的方法（如细胞计数法、克隆形成试验和3H-TdR掺入试验
8、等）有良好相关性。,MTT,注意事项1.MTT被活细胞中脱氢酶还原所形成的结晶产物不溶于水，需加入有机溶剂溶解后才能测定A值，选择不同的有机溶剂或结晶产物溶解不完全，对结果有一定影响。,2.酶标仪滤光片的选择 甲臢的吸收峰受一些因素的影响，如溶解甲臢的溶剂、pH等。因此，首先应用优质分光光度计测定实验对照组的最大吸收峰，在此基础上选择合适的滤光片。,MTT,3.细胞系的选择及接种的细胞数 由于实验应设计在活细胞数与A值呈线性关系部分进行，故应选用在47d生长速度适合作此项分析的细胞系。选择适量接种细胞数的原则是，实验对照组的细胞在实验结束时的A值与活细胞数之间仍处于线性范围（一般A值在0.22
9、.0之间）。,4.甲臢的生成不仅与活细胞数成正比，也受加入MTT后作用时间的影响，即A值可随着放置时间而改变。,MTT,5.培养液中的酚红、人血清蛋白、免疫球蛋白和某些添加剂可使A值增高。在进行MTT法测定时应先将这类物质洗去。,6.培养液中的血清可使A值增高，影响测定结果。解决方法：应用低于10%胎牛血清，加入DMSO之前尽量吸去孔内残余上清液，用10% SDS盐酸溶液代替DMSO。7.如用DMSO溶解受试药，DMSO终浓度应低于0.5%。,MTT,甲臢生成量与活细胞数成正比,但不能检测细胞的绝对数 关于每孔的细胞数预先摸索，勿多 关于边缘效应四周的孔只加无菌PBS 关于测定波长570nm？
10、490nm？ (460, 503, 540, 570, 590, 630 nm) 参比波长（450nm）：双波长分光光度法有测量波长和参比波长，选择参比波长是为了更好的消除干扰物质的影响。MTT试验生成的显色物和CCK-8试剂在参比波长处无吸光度。,MTT,在4存放的试剂，MTT、DMSO等用前室温平 衡30min 所用试剂要先除菌处理；勿触摸板底，防止污染 96孔培养板的底有不同形状，用途不同，平底者底面积0.32cm2，容积360l。,MTT,三、XTT法()基本原理XTT是MTT的衍生物, FW:673.5。当XTT与电子偶联剂硫酸酚嗪甲酯(PMS)同时使用时，XTT可被活细胞内线粒体脱
11、氢酶还原形成水溶性棕黄色代谢产物，其生成量与活细胞的数量呈正相关，在450nm波长处有较大的吸收峰。在一定范围内吸光度(A)与活细胞的数量呈线性关系，用酶标仪测定代谢产物的A值可反映活细胞的数量。,XTT,四、WST-8法()基本原理WST-8是四唑单钠盐。CCK-8试剂所含的WST-8在电子载体1-甲氧基-硫酸吩嗪甲酯(1-methoxy PMS)作用下，被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为水溶性黄色甲臢。细胞内生成的甲臢数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖测定、细胞毒性分析和抗肿瘤药物筛选等。,操作方法1.选用对数生长期贴附生长肿瘤细胞，用胰酶消化后，悬浮于含胎牛血清的培
12、养液中，轻轻吹打使成细胞悬液。2.96孔培养板孔内加入细胞悬液100l，置于37、5%CO2培养箱中培养。细胞接种后贴附需24 h，如不需要贴附，可以省去此步骤。,3.每孔加入不同浓度的受试药物，设相应对照组，在37、5%CO2培养箱中继续培养。加入药物后的培养时间，依药物的性质而定。4.每孔加入10l CCK-8试剂，轻轻振荡使试剂与培养液混匀。,5.在37、5%CO2培养箱中继续培养14h。由于细胞种类不同，形成的甲臢量也不同。如果显色不足，可以继续培养，以确认最佳培养时间。,6.用微型振荡器振荡培养板使颜色均匀后，用酶标仪在450nm波长测定A值(参考波长655nm)。测定时需减去空白对
13、照组(孔)的A值（不含细胞的培养液中加入CCK-8试剂）。,结果评定同MTT法。注意事项1.本法采用单一试剂，操作简单，敏感性高，重复性好。2.CCK-8试剂在4、避光条件下可保存1年。如需长时间保存，应置于20。CCK-8试剂应避免反复冻融，经常使用可将试剂置于4冰箱。,3.由于每孔加入的CCK-8试剂的量比较少，可能会因试剂沾在孔壁上而导致误差，故在加完试剂后应轻轻敲击培养板以助混匀。也可以用培养液适当稀释CCK-8试剂，混匀后加入。,4.与贴附生长的细胞相比，CCK-8试剂用于悬浮生长的细胞显色比较困难。可通过延长加入CCK-8试剂后的培养时间或增加细胞数量来解决。,5.加入的受试药物如
14、果具有还原性，会与CCK-8试剂反应，可增加吸光度。,6.关于不同种类细胞的适宜接种细胞数、培养基及其用量、CCK-8试剂的用量以及加入CCK-8后的培养时间等，可参考生产商提供的资料。,7.AlamerBlue是近年美国Biosource Int公司开发的一种水溶性染料，其用途与CCK-8试剂相似。,五、磺基罗丹明B法(),磺基罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)是一种粉红色蛋白质结合染料, 含二个磺基, 可溶于水。在酸性环境下, SRB能与三氯醋酸(TCA)固定后细胞内大分子中的碱性氨基酸结合,被结合的染料的量在一定范围内与活细胞中蛋白质的量成正比, 而蛋白质的量与细胞的数
15、量成正比。因此, 可根据染色强度推测活细胞数。,六、克隆形成试验()克隆形成试验（clony-formation test，也称集落形成试验）是评价抗肿瘤药物作用的简便、可靠的体外方法，目前较为常用。,基本原理克隆(clone)是指一个细胞在特定条件下培养增殖而产生的细胞群. 当单个细胞连续分裂6代或以上时, 其后代所组成的群体即集落, 凡一个集落超过50个细胞者即为一个克隆, 大小在0.31.0 mm, 能形成克隆的细胞称克隆原细胞(干细胞)。肿瘤细胞的生长、转移、复发均以干细胞的增殖为基础。,当接种的细胞分布较稀疏时，每个克隆彼此不接触，通过克隆计数，可对单个细胞的增殖能力进行定量分析，故
16、能较灵敏地检测药物的抗肿瘤活性。 克隆形成试验可分为平板克隆形成试验及软琼脂克隆形成试验两种。,(一)平板克隆形成试验()是指在培养皿上观察克隆形成，该法适合于贴附生长的培养细胞，如口腔癌KB、B16等。,操作步骤1取生长良好的贴附生长细胞1瓶，瓶口过火后弃去培养液，用PBS洗1次。2用胰酶消化5min左右，在显微镜下观察细胞呈球状时，加入含10%小牛血清的培养液。,31000r/min离心10min后收集细胞，用含10%小牛血清的培养液制成单细胞悬液，并调节至每1ml含60个细胞。,4取5ml单细胞悬液注入直径60mm塑料培养皿中，每皿含300个细胞。以“十”字方向轻轻晃动培养皿，使细胞均匀
17、分散铺满培养皿后，将培养皿置于5%CO2培养箱37过夜。,5在倒置显微镜下观察细胞贴附和分布情况，若贴附良好，分布均匀，弃去培养液即可加入5个以上不同浓度的受试药(一般用含10%小牛血清的培养液配制)，每个浓度至少3皿，受试药与细胞作用一定时间(224h或更长)后，弃去含药培养液。,6用新配制的培养液漂洗3次后，加入无药含血清培养液，静止培养至1012d,即可进行克隆计数。,7计数前弃去培养液，用PBS洗涤l2次，加入新配制的甲醇-冰醋酸液(3:l)35ml固定10min，弃去固定液。待稍干燥后加入10%Giemsa染色液染色约20min，当克隆明显着色时，用水洗去染色液。以含50个细胞以上的
18、细胞团作为一个克隆，在20倍解剖显微镜下进行克隆计数。,结果评定按下述公式计算克隆形成率和克隆形成抑制率：克隆数 克隆形成率（%） 100%接种细胞数加药组平均克隆数 克隆形成抑制率(%)(1 )100%实验对照组平均克隆数,一般以克隆形成抑制率与剂量的对数作图, 得出一条S形曲线即剂量反应曲线, 并求出药物的半数抑制浓度(IC50),受试药的 IC50小于10g/ml时值得进一步试验.,注意事项1.细胞悬液中的细胞应充分分散,单个细胞至少在90%以上,否则试验误差大。2.在培养早期不要晃动培养皿。3.实验对照组（不加药物仅加生理盐水）的克隆形成率应在40%60%。4.若待试药为中药粗制剂,
19、如水煎剂,醇提液, 应用含药血清。,(二)软琼脂克隆形成试验() 悬浮生长的细胞必须在软琼脂培养基内增殖才能形成克隆。当然, 很多贴壁生长的细胞也能在软琼脂中形成克隆。本方法适用于L1210、HL-60、B16、KB细胞。,七、染料拒染试验法()基本原理 活细胞有排斥某些染料如台盼蓝、伊红、苯胺黑等的能力, 而死亡的细胞由于膜完整性破坏, 可被着色。,八、细胞生长曲线法()基本原理在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数（Y轴）对培养时间（X轴）作图，可得一条斜率向上的直线。但随着培养时间的延长，细胞密度不断增加，由于代谢产物的堆积及营养物质的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止
20、，生长曲线的斜率逐渐变平，进入平台期。因此，药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来。,第七节 肿瘤侵袭与转移的研究方法,肿瘤细胞具有多种生物学特性，其中侵袭和转移是最重要的特性之一，也是恶性肿瘤的重要标志。肿瘤侵袭(invasion)是指恶性肿瘤细胞突破基膜和细胞外基质(ECM)构成的组织学屏障，侵犯到邻近的正常组织，并在该处继续繁殖生长的过程。侵袭是贯穿肿瘤转移全过程的重要步骤，瘤细胞穿入、穿出血管或淋巴管和侵入靶器官都是侵袭行为的具体表现。,肿瘤侵袭是一系列多步骤的复杂过程，可分为四个步骤：肿瘤细胞彼此间的粘附力减低，使细胞彼此分散；肿瘤细胞通过胞膜表面粘附分子受体与基膜、ECM成分的
21、层粘蛋白、纤连蛋白及胶原蛋白等结合；,细胞间粘附力减低,粘附分子受体与ECM成分结合,肿瘤细胞分泌和活化蛋白水解酶前体，蛋白水解酶降解由细胞间基质和基膜组成的ECM，主要是降解构成基膜的主要成分型胶原；肿瘤细胞穿过破损的基膜和基质，借助于自身的阿米巴运动而游出，迁移到其周围，发生侵袭性生长。上述步骤反复进行，肿瘤逐渐向深层及周围侵袭。,蛋白酶降解ECM,肿瘤细胞穿过破损基膜和基质,肿瘤转移(metastasis)即恶性肿瘤细胞借助血道、淋巴道等途径，在远离肿瘤原发生长部位形成继发瘤的过程。肿瘤转移始于恶性侵袭，转移是连续多步骤的过程，主要有：,原发瘤增殖，肿瘤新血管生成；肿瘤细胞侵袭毗邻的基膜
22、、基质和正常细胞；瘤细胞穿入血管或淋巴管并在循环系统中存活；瘤细胞栓塞、滞留于远处靶器官的微血管中并增殖；瘤细胞穿出血管，在靶器官内形成微转移灶；肿瘤间质内新血管生成，转移瘤快速生长。可见，在转移过程中肿瘤细胞需穿过三个基膜屏障而形成转移灶。,恶性肿瘤侵袭与血行转移,侵袭和转移是肿瘤恶性行为的最本质特征。侵袭和转移的关系密切，高侵袭性肿瘤通常具有高转移能力。就大多数恶性肿瘤而言，侵袭和转移是一个过程的两个阶段，即侵袭是转移的前奏和基础，转移是侵袭的结果。侵袭和转移是恶性肿瘤威胁人类健康与生命的主要原因，防治肿瘤的侵袭、转移是降低肿瘤死亡率的重要途径之一。,一、肿瘤侵袭的常用体内模型(一)小鼠子
23、宫颈癌U14肾侵袭模型()现多以昆明小鼠为宿主。小鼠子宫颈癌U14为实体型，具有血液和淋巴系统双重转移特点，淋巴转移率90%，并可发生肺转移，但自发转移率不高。,(二)W256癌肉瘤骨侵袭模型()(三)肿瘤细胞侵袭的其他常用体内模型主要有皮下移植、肌肉移植、腹腔内移植、睾丸包膜下移植、耳廓皮下移植、爪垫皮下移植、视网内界膜侵袭模型等。,二、肿瘤侵袭的常用体外研究方法(一)重组基膜侵袭实验()基本原理重组基膜侵袭实验又称Boyden小室肿瘤侵袭实验。基膜是限制肿瘤细胞侵袭生长的组织屏障。肿瘤细胞侵袭时，首先通过膜表面受体与基膜成分粘附，然后释放和激活多种蛋白酶降解基膜，继而穿越基膜的缺损部位。突
24、破肿瘤基膜屏障是肿瘤侵袭至周围正常组织的启始步骤和关键环节。,Matrigel（基质胶）是从EHS鼠肉瘤中提取的基质成分，含有层粘蛋白、型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等。将其铺在无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯(PVPF，孔径8m)多孔滤膜上，能在培养基中重组形成与天然基膜极为相似的人工基膜结构。,Boyden小室,上室,下室,Boyden小室分为上室和下室，两室以Matrigel隔开。上室-肿瘤细胞，下室-趋化因子.,Matrigel,聚碳酸酯膜,当肿瘤细胞分泌的蛋白酶降解了Matrigel后，细胞运动到膜的下室面。通过计数膜下室面上的细胞数可定量地反映肿瘤细胞在体外的侵袭能力。,本方法操作简单、快
25、速，可以定量检测肿瘤细胞的侵袭能力，与动物体内侵袭模型具有良好的相关性，近年应用较多。,Boyden小室肿瘤侵袭实验,1.条件培养液的制备 NIH 3T3细胞用含10%小牛血清的高糖DMEM培养液培养，当细胞铺满瓶底时(约1107个细胞)，弃培养液，用无血清培养液洗23次，然后加入1.5ml无血清培养液，37、5% CO2培养箱培养24h。收集上清液，即为含趋化因子的条件培养液，作为趋化因子的来源。过滤除菌，20保存。,2.铺基质胶 使用前1天将基质胶从20置于4融化，并用无血清培养液按1:3稀释，即60l基质胶加入180l无血清培养液，混匀。将稀释的基质胶铺在已置于Boyden小室上室的PV
26、PF滤膜上，分2次铺放，每次间隔10 min(此操作均在冰上进行)。然后将Boyden小室置于37孵育30 min。用前紫外线照射2h。,3.细胞药物处理 在培养肿瘤细胞的培养瓶中加入不同浓度的受试药物，按设定的时间进行药物处理。,4.收集细胞 将处理的肿瘤细胞用0.25%胰蛋白酶消化肿瘤细胞，用无血清培养液调节细胞浓度为2106个细胞/ml。,5.取出制备好的Boyden小室，在24孔培养板内加入NIH 3T3细胞条件培养液200l，将Boyden小室置于其内，向小室上室面加入100l处理的肿瘤细胞悬液，于37、5%CO2条件下孵育46 h。,6.取出Boyden小室，弃去上室中的培养液，并
27、用生理盐水棉签轻轻擦去滤膜上室面的细胞，PBS洗3次，醋酸-酒精-甲醛固定液固定基质胶20min，HE染色，中性树胶封片。7.侵袭细胞的计数 在400倍视野下任取10个不重复视野，利用方格式目镜测微尺计数每个视野中膜下室面的肿瘤细胞数目，计算平均值。,膜下室面的肿瘤细胞,未用抗肿瘤药物处理,抗肿瘤药物处理后,注意事项1.Boyden小室为杯状器皿，形状不尽相同，名称不一（Transwell，Millicell）但工作原理基本一致。2.基质胶在20以下为黄绿色固体，4时是液体，在22以上时可形成胶冻状物，不可逆，用前4过夜可融化。,3.使用时将基质胶放在冰上，铺胶时使用的所有器具需预冷。4.因肿
28、瘤细胞种类的不同，其穿过人工基膜的时间也不相同，一般在37、5%CO2条件下孵育46 h，穿过人工基膜的细胞以每视野50100个为宜。,(二)肿瘤细胞球体的侵袭实验（x ),三、肿瘤转移的常用体内模型(一)B16-BL6小鼠黑色素瘤自发转移模型()造模原理B16细胞是1954年在C57BL/6小鼠耳根部皮肤上发现的自发性黑色素瘤细胞，移植后主要发生肺转移。,B16-BL6细胞来源于B16细胞，具有高度转移能力。将瘤细胞移植于局部，瘤体增殖生长后，侵袭周围正常组织和血管，进入血循环，到达远处部位发生转移，称为自发性转移。此模型可反映”瘤细胞侵袭血行播散侵袭”的完整转移过程，用于观察药物对肿瘤侵袭
29、和转移能力的影响。,操作方法1.瘤液制备 取对数生长期的B16-BL6细胞，吸弃培养液，用PBS洗净，用EDTA消化，加一定量培养液离心收集细胞，重悬于PBS中，将细胞浓度调整为1107个/ml。2.肿瘤接种 在每只C57BL/6小鼠后肢爪垫皮下注射50l瘤液（含5105个细胞）。,3.分组与给药 肿瘤接种次日将动物随机分组，设给药组、阳性对照药组(环磷酰胺100 mg/kg)及实验对照组，每组10只小鼠，连续给药3周。4.切除原发灶 给药3周后（瘤体10mm），称体重，乙醚麻醉下结扎股动脉后，截除荷瘤小鼠的后肢。,5.观察肺转移瘤灶 停药1d后，继续连续给药3周。于末次给药24h后，处死小鼠
30、，解剖取肺，用Bouin液固定，在10倍解剖显微镜下计数肺组织表面肿瘤结节数。,黑色素瘤肺转移,(二)Lewis肺癌自发性肺转移模型()Lewis肺癌种植于动物皮下后可通过血行播散到肺部形成转移灶，故常被用作肿瘤血行转移研究的模型。Lewis肺癌移植于动物皮下等特定部位，移植瘤增殖后侵袭周围正常组织和血管，继之癌细胞进入血液循环形成血行播散，粘附于靶器官（主要是肺脏的血管壁）。,随后，癌细胞穿出血管，在肺内增殖最终形成肺转移瘤。上述移植后的增殖、侵袭、转移到最终形成转移瘤的过程，基本类似于人类肿瘤从生长到转移瘤形成所经历的一系列步骤，故称之为癌的“自发性转移模型”。Lewis肺癌是迄今研究肿瘤
31、转移的首选模型。,操作方法1.取皮下接种1014d的Lewis肺癌作为瘤源，剥离肿瘤，选取生长良好的瘤块，按肿瘤:生理盐水1:3匀浆，制备成(12)107/ml单细胞匀浆液。2.在C57BL/6小鼠腋窝皮下接种匀浆液，每只鼠0.2ml（21064106个/0.2ml）。3.接种次日开始治疗，接种后28d颈椎脱臼处死动物，结束实验。,4.称小鼠体重和肺重，肺转移瘤越多则肺越重。5.肺用Bouin液固定48h后，可见肺组织呈黄色，肿瘤转移灶呈白色隆起。肉眼或在解剖显微镜下计数肺转移瘤灶，正、反面及肺叶间的瘤灶均应计数在内。计数后按下式计算肺转移抑制率：,给药组平均肺转移瘤数 肺转移抑制率(%)（1
32、 ）100%实验对照组平均肺转移瘤数,注意事项1.为确保Lewis肺癌的高转移性，必须正规传代。2.实验周期较长，小鼠易发生营养不良，应加营养。3. 小周龄的小鼠体内NK细胞活性较低，610周龄活性达到高峰，10周龄后逐渐下降，故较小或较老的小鼠肺转移率会升高。,4.如果采用爪垫皮下接种的方法，则在C57BL/6小鼠后爪垫接种上述肿瘤匀浆液0.02ml/鼠(含细胞2105 4105个)，1012d左右从膝关节截除荷瘤后肢，此时肺内肿瘤微转移灶已形成。第30天结束实验，观察肺转移瘤。机制可能是由于切除荷瘤足后可以促进肿瘤自发性肺转移。,(三)LA-795小鼠肺腺癌转移模型(）,(四)小鼠黑色素瘤
33、B16-F10人工肺转移模型()造模原理B16-F10是Fidler从B16细胞中筛选出的肺部高转移克隆株，命名为B16-F10。小鼠静脉内移植B16-F10细胞后主要形成肺转移瘤，肺外转移极少。B16-F10人工肺转移模型是将瘤细胞直接注射到小鼠血液循环中，导致肿瘤的肺部转移。,把大量瘤细胞直接移植入血液循环，实质上省略了肿瘤转移过程中瘤细胞局部侵袭和侵入血管的步骤，故称为“人工转移” 或“实验性转移”模型，有别于肿瘤的“自发性转移”模型。,人工转移模型集中体现了肿瘤细胞进入血液循环之后肿瘤转移的几个步骤，对于研究肿瘤细胞在循环系统中的生存能力、瘤细胞附着、穿越靶器官血管的能力以及探讨肿瘤转
34、移的器官特异性等，具有其独特优势。,操作方法1.用胰酶消化体外培养的B16-F10细胞，以PBS冲洗3次，过200目筛网，获得单细胞。用PBS调整瘤细胞浓度为106个/ml。2.将C57BL/6小鼠尾巴浸泡于45的温水中2min，使尾静脉扩张。每只鼠尾静脉注射0.2ml瘤液。,3.第20天颈椎脱臼法处死小鼠，结束实验。称体重、肺重，解剖显微镜下计数肺转移瘤灶。转移瘤呈黑色或灰色，相互间很少汇合。4.Bouin液固定、制片，进行组织病理学观察。,注意事项1.C57BL/6小鼠尾静脉较细，更受黑色皮肤遮盖而难以辨认。局部加温后可使尾静脉充分扩张，提高静脉注射的成功率。2.B16-F10细胞须分散成
35、单细胞后才可静脉注射，粘附成团的瘤细胞会增加肺转移瘤数，导致组内误差增大。,(五)小鼠Hep肝癌脾内移植肝转移模型（略）(六)黑色素瘤脾内移植肝转移模型（略）,第八节 肿瘤细胞分化诱导的 体外研究方法,肿瘤细胞可视为正常细胞分化受阻或分化失控，成为不衰老的永生细胞。近年研究表明，某些恶性肿瘤细胞在体内外诱导剂的作用下，可重新分化，向正常细胞逆转，这种现象就是肿瘤细胞的诱导分化（induction of differentiation）。肿瘤分化诱导疗法具有特殊的优越性，特别维甲酸在急性白血病治疗的成功后,可用人早幼粒白血病HL-60细胞、小鼠黑色素瘤B16细胞、肝癌Bel7402细胞、人结肠癌
36、HT-29细胞等进行细胞的分化诱导试验，但不同组织来源的肿瘤细胞其分化标志不尽相同。目前应用较多的是HL-60细胞。,第九节逆转肿瘤耐药性药物的 研究方法,几乎所有抗癌药物长期应用后都会诱导耐药性，肿瘤细胞对药物产生耐药性是肿瘤化学治疗失败的主要原因之一。按耐药性的来源，肿瘤细胞耐药性可分为：先天性耐药（intrinsic drug resistance）获得性耐药（acquired drug resistance）,按耐药特点可分为：原药耐药性（primary drug resistance）多药耐药性（multidrug resistance，MDR）,原药耐药性只对诱导的原药产生耐药，而
37、对其他药物不产生交叉耐药；多药耐药性是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制不同的其他抗肿瘤药物也产生耐药性。,产生多药耐药性的药物多数为分子量较大的天然产物，脂溶性较大，包括长春碱类、秋水仙碱、高三尖杉碱、蒽环类抗生素、更生霉素、丝裂霉素、紫杉醇等。,MDR的发生机制十分复杂，其中多药耐药基因MDR编码的P糖蛋白(P-gp，P-170)高表达是主要机制。P-gp是分子量为170kD、具有能量依赖性药泵功能的跨膜糖蛋白，在人类主要由MDR1产生。MDR表达产物P-gp可将亲脂类化疗药物泵出细胞外，从而产生耐药性。,用肿瘤耐药细胞株在体外筛选新的逆转剂，是寻找肿瘤耐药性逆转
38、剂的有效方法。耐药细胞株可以由实验室自行建立，也可以从国内细胞库购得。,操作方法1.耐药细胞株的建立 2.检测受试药物的细胞毒性 采用MTT法测定受试药物对敏感细胞株和耐药细胞株的细胞毒性。,3.细胞存活率的测定和逆转倍数的计算 采用MTT法测定细胞存活率。存活率按以下公式计算：,加药组A值不加细胞组A值 存活率= 100%不加药对照组A值,从各组求出存活率的直线回归方程，再从此方程求出半数抑制浓度IC50。用逆转倍数(fold reversal, FR)评价逆转效果，逆转倍数的计算公式为：,IC50（不加逆转剂） 逆转倍数IC50（加逆转剂）,本章学习要点 自发性、诱发性和移植性肿瘤的概念 实体型移植性肿瘤接种的基本过程 腹水型肿瘤移植的主要步骤 瘤重抑制率和生命延长率的计算 MTT法的基本原理和主要操作方法 克隆形成试验的基本原理和主要操作方法 重组基膜侵袭实验的基本原理 自发性转移模型和人工转移模型的概念 Lewis肺癌自发性肺转移模型的原理和主要操作方法 肿瘤细胞冻存及复苏的方法,
