1、肝衰竭免疫发病机制若干研究进展,2011年3月26日 中国 西安,浙江大学医学院附属第一医院 传染病诊治国家重点实验室 陈 智,免疫耐受,免疫损伤,损伤加剧,正常人,携带者,慢乙肝,重症肝炎,1、免疫耐受,缺乏对发病机制全面准确的了解,2、免疫损伤,3、肝炎重症化,4、肝癌,乙型病毒性肝炎发病机制研究,固有免疫,特异性免疫,细胞因子风暴,细 胞 凋 亡,肝衰竭免疫发病机制,Toll样受体（TLRs）,模式识别受体,固有免疫,固有免疫细胞 肝脏有体内最大的巨噬细胞群库普弗细胞、多种类型的DCs、NK和NKTs，均为固有免疫系统的重要成员，也是肝脏执行固有免疫功能的结构基础。 重型肝患者中，可能有
2、较多的N K细胞及NKT细胞浸润到肝组织中，通过分泌IFN等促炎因子而引起肝组织的损害,巨噬细胞与重型肝炎的关系,巨噬细胞的浸润及枯否细胞增生是重型肝炎的典型特征。 活化巨噬细胞分泌的多种细胞因子似乎在重型肝炎发病中起着至关重要的作用,其通过多种机制导致肝细胞损伤。 在H B V转基因小鼠暴发型肝衰竭模型中，IFN-激活巨噬细胞启动的迟发性超敏反应是肝脏大面积坏死的原因。,巨噬细胞的激活及其作用,迟发性超敏反应,肝细胞大量坏死,氧自由基,IL-1 IL-8 TNF- IL-6 IL-10 GM/G/M-CSF IFN- ,免疫凝血物质，如组织因子和fgl2(人纤维介素蛋白)凝血酶原酶,纤维蛋白
3、的沉积 微血管血栓的形成 白细胞聚集 炎性反应的上调,细胞因子风暴,NO,迟发性超敏反应,肝细胞大量坏死,宿主CTL反应,CTL:穿孔素、细胞毒素,介导细胞凋亡,TH,特异性免疫,免疫调节T淋巴细胞（Tregs）,Tregs由多种独特的T淋巴细胞亚型所组成，虽然所占比例很小，但在保持对自身抗原和外来抗原耐受方面具有极其重要的作用。,王福生教授课题组研究表明：与正常人相比，慢性重度乙型肝炎患者外周血和肝脏组织内CD4+CD25+Treg细胞均明显增多，并且Foxp3阳性细胞和炎症细胞在肝脏内急剧聚集。 Nakayama Y 等人将腺病毒编码的CTLA-4Ig （AdCTLA-4Ig） 注入LPS
4、 诱导的暴肝小鼠体内，发现治疗组小鼠全部存活，肝出血性损伤及血清转氨酶显著降低。 我们研究也证实了CTLA4与肝炎重症化密切相关。,免疫调节T淋巴细胞,Th17细胞,IL-6+TGF-beta可以刺激Th17分化；Th17分泌的CK主要是：IL-17,IL-22,IL-21等 Th17能迅速启动由中性粒细胞介导的炎症反应过程,许多病原体感染都主要通过Th17途径被控制。过去大量的研究表明病毒型肝炎的发生是Th1介导的，最近发现Th17细胞与病毒性肝炎的肝脏损伤密切相关。,郑树森院士课题组的研究表明（J Clin Immunol，2010）急慢性HBV患者的肝脏有大量的IL-17+细胞浸润，肝内
5、IL-17+细胞的数量与肝脏的炎症程度成正比，且HBV患者肝内IL-17+细胞和IL-8的表达以及中性粒细胞的浸润程度正相关。 王福生教授课题组的研究表明：（Hepatotogy，2010）对CHB患者的Th17细胞进行研究发现CHB患者外周血和肝内的Th17细胞显著高于正常人。Th17细胞的升高可以进一步激活mDCs和单核细胞，促使它们释放炎症细胞因子，,Th17细胞,细胞因子风暴,随着活化的淋巴细胞、巨噬细胞NK细胞、NKT细胞等浸润释放细胞因子并不断放大、相互作用形成网络，诱导肝细胞凋亡，促进白细胞活化和单核细胞的浸润，并诱导血管粘附分子的改变。包括TNF-a、IFN-、IL-6、IL-
6、8/IL-15 。 IFN-是由激活的T 细胞和NK 细胞产生的细胞因子，可以抑制病毒复制， 对调节机体的免疫应答具有重要作用。对重型肝炎患者肝内细胞因子表达的研究结果显示慢性重型肝炎组IFN-水平显著高于CHB组和正常对照组。,进一步激活固有和特异性免疫及迟发性超敏反应,肝细胞凋亡,死亡受体介导肝细胞凋亡,FasFasL TNFTNFR1 TRAIL1TRAILR1 TRAIL-2 /TRAILR2,TNFTNFR1系统,研究发现急性暴发性病毒性肝炎患者血清中TNF、可溶性的TNFR1和TNFR2均升高 提示TNF可能与大面积肝坏死有关，可能是因为激活NFB、JNK激酶，诱导细胞凋亡 检测血
7、清中可溶性TNFR1可用于判断急性暴发性肝炎的预后,NF-kB activation,TNF-RI (p55),TNFa,TRADD,RIP,TRAF 2,pro-caspase 8,CARD,caspase cascade,MAP3K,JNK,c-Jun,AP-1,Gene Activation,Apoptosis,Death domain,Death domain,TRADD,FADD,Death domain,kinase,Death domain,effector domain,caspase 8,FasFasL配体系统,Fas单克隆抗 体注入小鼠体内，发现肝细胞大量凋亡并引起暴发性肝
8、炎 暴发性肝炎时肝细胞不表达 bcl-2。 bcl-2转基因小鼠实验证实， bcl-2能保护肝细胞免遭Fas介导的 cTL对肝细胞的杀伤,TRAIL1和TRAIL-2TRAILR1和TRAILR2系统：,TRAIL区别于TNF、FasL最为显著的特点是特异性诱导转化细胞、肿瘤细胞和病毒感染细胞发生凋亡，而不影响正常组织细胞的功能。也正是因为这一特性，目前TRAIL己成为众多研究的焦点 。研究发现，重型肝炎患者血清可溶性TRAIL显著升高，且与血清LPS浓度以及肝脏损伤严重程度呈正相关。另有研究表明，HBV感染患者体内HBX蛋白的表达使得肝细胞在TRAIL-诱导下发生凋亡。HBV的C 蛋白可以抑
9、制TRAIL-介导的肝细胞凋亡。,肝衰竭分子机制研究的临床意义,明确临床起病前，患者体内发生了什么样的分子改变，有助于早期诊断和治疗 阐明肝衰竭发生的早期事件有助于患者的早期诊断，降低发病率 对肝衰竭患者进行早期干预、早期治疗是助于降低病死率,暴 肝 进 展 过 程,起病,大量分子水平变化,急 转 直 下,发现CD4 + CD25+Treg在乙肝病毒 感染后免疫耐受机制中起重要作用,发现HBcAg、HBxAg、IL-10等通过调节 TH17细胞的数量和功能对肝脏炎症产生影响,前期研究回顾,重症肝炎发病相关分子的筛选和研究,我们研究组近期部分研究结果,HBsAg作用于DC细胞后，免疫Balb/C
10、 小鼠和HBV转基因鼠,HBV DNA滴度下降,回顾前期研究： 采用乙肝抗原肽刺激DC细胞，能部分打破免疫耐受,A：免疫后2周,B：免疫后4周,脾细胞的CTL活性增强,慢乙肝组患者外周血CD4 + CD25+ T细胞频率显著增高,eAg（）患者外周血CD4+CD25+ T细胞频率高,CD4+CD25+ T 细胞/CD 4+在慢性肝炎患者外周血中表达高,Peng GP,Immunology. 2008,123(1):57-65,发现CD4 + CD25+调节性T细胞在乙肝病毒感染后免疫耐受机制中起重要作用,137例乙肝患者外周血用流式细胞术进行检测,TrehanPati在Hepatology上引
11、用：慢性重度患者中的外周CD4+CD25+ 调节性T细胞的频率显著高于慢性轻度及急性早期患者,细胞因子，IL4、IL-10、TGF-,CD4+CD25+,丰富了乙型肝炎免疫耐受机制,重点研究,在机体对乙肝病毒耐受的情况下，为什么患者还会出现严重的肝损伤呢,？,TH17水平与病毒载量、转氨酶呈正相关,TH17在乙肝损伤中起重要作用,慢乙肝组患者外周血TH17细胞明显增高，且随着病情加重Th17/Tc17百分比增加,HBcAg可诱导慢性肝炎患者的PBMC分泌多种Th17相关因子（TH17A、IL22、IL23、IL6、TGF、IL10），而在健康人PBMC中没有明显改变,Li Jie, Antiv
12、iral Research，2010,85(3): 463-469,多种因素可调控TH17细胞功能HBcAg作用,正常对照,Wu W, et al. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 2010, 25(4):750-757,去除CD4 + CD25+ 调节性T细胞后对慢性乙型肝炎患者PBMC中HBcAg诱导的Th17细胞亚群表达增加,Th17与CD4 + CD25+ 调节性T细胞相关性研究,应用miRNA抑制PBMC中的FOXP3后，HBcAg诱导的TH17的百分比更高,HBxAg可通过MyD88使IL6提高，后者可造成前体细胞向TH17细
13、胞分化,多种因素可调控TH17细胞功能HBxAg作用,HBx基因在肝和肝癌细胞的表达导致IL-6合成和分泌提高。这些细胞中MyD88的失活阻止了HBx触发的IL - 6产生。HBx蛋白的表达也激活了MyD88的下游信号蛋白,如IRAK- 1等，如用相应的抑制剂这些信号分子，从而阻断了IL - 6的合成,Li J,et al. Immunol Cell Biol. 2010,88(8):834-841,给予IL10干预，可抑制多种TH17相关因子（TGF1除外）,IL10水平与肝炎炎症程度呈负相关,IL10水平与TH17细胞频率呈负相关,多种因素可调控TH17细胞功能IL-10作用,IL-10,
14、IL-10,ALT,Th17,IL-10对rHBcAg诱导的Th17相关细胞因子分泌的调控,IL10下调CD4T细胞上的RORt分子表达，抑制对HBcAg诱导的TH17细胞免疫反应,多种因素可调控TH17细胞功能 IL-10作用,该作用与CD4+CD25+ 调节性T细胞的参与无关,不同感染阶段：慢乙肝患者CD8+T细胞,尤其是HBV特异性CD8+T细胞上PD-1表达水平升高,使用PD1单抗阻断后，可有效增强慢乙肝患者PBMC增殖和IFN-水平,多种因素可调控TH17细胞功能PD1作用,Peng GP, Mol Immunol,2008,45(4):963-970,Fourcade 在 J Im
15、munol 上引用：PD-1/PD-L1通路在病毒特异性的细胞功能耗竭中起重要作用,PD-1表达水平,骨桥蛋白调节NKT细胞对肝细胞的杀伤功能,多种因素可调控TH17细胞功能骨桥蛋白作用,骨桥蛋白发挥细胞杀伤作用通过Fas-FasL系统实现,多种因素可调控TH17细胞功能骨桥蛋白作用,首次发现骨桥蛋白能调节NKT细胞的成熟与功能。骨桥蛋白的缺失会造成免疫细胞产生TH2细胞因子能力降低，引起细胞毒功能的降低，肝损伤的减轻。 发现肝炎中NKT细胞通过骨桥蛋白进行免疫调节作用,Proc Natl Acad Sci U S A.105;41:15884-15889，2008,明阐TH17在乙肝损伤中的
16、作用机制指导临床诊疗,IL-10,IL-6,Th17,IL-17A、IL22、IL23、IL6、TGF、IL10等,炎症加重,HBxAg,MyD88,HBcAg,miRNA 封闭FoxP3,CD4CD25调节性T细胞,骨桥蛋白,NKT,TH2CF,肝衰竭过程中信号通路改变规律,动物实验：ConA尾静脉注射小鼠制备暴发性肝炎动物模型,不同时间点小鼠肝脏的病变及肝功能变化,小鼠肝脏基因表达谱芯片研究,小鼠基因表达谱芯片,Affymetrix GeneChips Mouse 430 2.0 Arrays,基因聚类分析结果,样本聚类分析结果,表：在三个时间段差异表达的基因数量,生物信息学处理,将单个基因置于整体的生物学图景中加以审视，研究基因间相互联系 集中于通路信息研究,基因间相互作用网络图,Toll样受体信号通路图,细胞因子及其受体信号通路,CAO QY,et al. JZUS-B, 2010，11（5）：366-377,凋亡信号通路,NK细胞介导的细胞毒性通路,信号通路具体变化情况,提出肝衰竭启动、进展和剧烈炎症反应三个阶段，发现三个阶段的不同特征和分子改变,Toll样受体信号通路的激活,Th1 类细胞因子的大量分泌,CTL, NK 细胞的激活,肝细胞凋亡,肝功能紊乱,+,+,研究团队,谢谢！,
