1、第一章 蛋白质化学,生物功能的载体和执行者,蛋白质,Protein,第一章 蛋白质化学,1 .蛋白质的生物学意义 2 .蛋白质的元素组成 3 .蛋白质的氨基酸组成 4 .肽 5 .蛋白质的结构 6 .蛋白质分子结构与功能的关系 7 .蛋白质的性质 8 .蛋白质的分类,1 蛋白质的生物学意义,生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。 -恩格斯于1878年 蛋白质是生物功能的载体是生物功能执行者,1.催化 酶2.运输 血红蛋白，钠泵3.运动 肌球蛋白，肌动蛋白 4.免疫 免疫球蛋白5.调解 激素6.组分 构成生命体7.供能 氧化分解还有血型物质、信
2、息蛋白、锚定蛋白、储存蛋白、毒蛋白等。,蛋白质的主要生物学功能,蛋白质是一切生命的物质基础,蛋白质是生命活动的源泉,没有蛋白质就没有生命,2 蛋白质的元素组成,碳50-55%氢6-8%氧20-23%氮15-18%*平均含氮16%硫0%-4%有些蛋白质还含 有微量的磷、铁、锌、铜、钼、碘等元素。 蛋白质系数:6.25,蛋白质的元素组成特点,3 蛋白质的氨基酸组成,（一）氨基酸的结构通式 （二）氨基酸的分类 （三）氨基酸的重要理化性质,3 蛋白质的氨基酸组成,蛋白质含氮、相对分子质量大，结构复杂。蛋白质由20种氨基酸组成 依据：酸、碱、酶水解蛋白都获得氨基酸产物。氨基酸是指含有氨基的羧酸。除脯氨酸
3、 （亚氨基酸）外，均为-氨基酸。,富含氨基酸,（一）氨基酸的结构通式,（一）氨基酸的结构通式,甘氨酸的R为氢原子，无不对称碳原子（无旋光性）。其他19种氨基酸的- 碳原子都为不对称碳,所以氨基酸在结构上的两个特性为: (1)旋光性 (2)D-型和L-型两种立体异构,旋光性,- 碳原 不对称碳手性碳,氨基酸,a-碳原子,R基不同,a-氨基,氨基酸的构型,氨基位置,参照甘油醛,（二）氨基酸的分类,（二）氨基酸的分类,是酸性氨基酸（两个羧基）,碱性氨基酸 （多个氨基）,pH试纸变蓝色,Histidine His H,碱性,赖氨酸,LysineLys K,+NH3 - CH2 - CH2 - CH2
4、- CH2 - CH - COO-,NH3+,碱性,味道鲜美！,精氨酸,Arginine ArgR,NH2 C - NH - CH2 - CH2 - CH2-CH-COO-,NH3+,+ NH2,碱性,（二）氨基酸的分类,试纸检测,是酸性氨基酸（两个羧基）,变红了!,天冬氨酸,Aspartate Asp D,酸性,谷氨酸,Glutamate Glu E,酸性,（二）氨基酸的分类,丝氨酸(丝),Serine Ser S,羟基,苏氨酸（苏）,Threonine Thr T,NH3+,CH3 CH CH COO-,NH3+,OH,羟基,天冬酰胺,Asparagine Asn N,NH3+,酰胺,谷氨
5、酰胺,Glutamine Gln Q,NH3+,NH2 C CH2 CH2 CH COO-,NH3+,O,酰胺,酪氨酸,Tyrosine Tyr Y,NH3+, CH 2 CH COO-,NH3+,HO ,芳香,半胱氨酸,Cysteine Cys C,NH3+,只有我才能形成二硫键！,（二）氨基酸的分类,甘氨酸（甘）,Glycine Gly G,不含手性碳 无旋光性,最小 最简单,丙氨酸,Alanine Ala A,NH3+,缬氨酸(缬),Valine Val V,亮氨酸(亮),Leucine Leu L,异亮氨酸(异亮),Isoleucine Ile I,CH 3 CH2 CH CH COO
6、-,NH3+,CH 3,苯丙氨酸,Phenylalanine Phe F,芳香,甲硫氨酸（蛋氨酸）,Methionine Met M,含硫、起始,脯氨酸,Proline Pro P没有游离的氨基,亚氨基酸,色氨酸,Tryptophan Try W, CH 2 CH COO-,NH3+,N H,芳香杂环,氨基酸的分类,基本氨基酸稀有氨基酸非蛋白质氨基酸（还有直链、支链等等分类方法）,经化学修饰乔装打扮了！,氨基酸,记忆指导：1. 两种酸性的氨基酸及它们的两种酰胺2. 三种碱性氨基酸（多氨基）3. 含苯环、杂环的4. 含OH、S 的5. 不同碳架（链长、分支）。,氨基酸的结构特点,（三）氨基酸的重
7、要理化性质,1. 物理性质 2. 两性解离和等电点 3. 化学性质,1. 物理性质,（1）无颜色 （2）熔点极高，一般在200以上（3）能溶于稀酸、稀碱，但不溶于有机溶剂（4）味道多样，有甜、有苦、有鲜（5）大多都有旋光性（甘氨酸没有） （6）芳香族氨基酸有紫外吸收能力,共轭结构,2. 两性解离和等电点,氨基酸是两性离子、两性电解质。既能像酸一样放出质子。也能像碱一样接受质子。,低于PI显 +,等电点PI （兼性离子）,高于PI显 -,pH大小影响氨基酸的解离状态,由实验测定:根据氨基酸羧基和氨基的pK值（即解离常数的负对数）来计算。一氨基一羧基氨基酸的解离、 pK值及pI的计算公式如下:,氨
8、基酸的pI值：,pI = (pK1 + pK2) / 2,一氨基二羧基氨基酸如天冬氨酸， 在不同pH值时的解离情况如图所示。,综上所述：各种氨基酸的等电点为两性离子两侧两个pK的平均值。每种氨基酸都有特定的等电点，当溶液的pH值低于某氨基酸的等电点时，则该氨基酸带正电荷，在电场中向负极移动。当溶液的pH值高于等电点时，则该氨基酸带负电荷，在电场中向正极移动。当液的pH等于等电点时，氨基酸所带净电荷为零，在电场中不移动。,等电点的特点和意义：,溶解度最低，易沉淀，用于分离纯化等。等电点时不电泳，电泳液的pH值要偏离等电点。,与茚三酮的反应在570nm比色可知氨基酸的含量。该反应十分灵，几微克氨基
9、酸就能显色。多肽或蛋白质也能与茚三酮反应，但肽越大，灵敏度也越差。,这是氨基酸的首选颜色反应,3. 化学性质,3. 化学性质,与甲醛的反应氨基酸是两性离子，不能用酸或碱滴定测其量。氨基酸可与甲醛反应，使溶液酸性增加，再以酚酞作指示剂用aOH来滴定。 由滴定所用的aOH量就可以计算出氨基酸的含量甲醛滴定法。,变通一下再滴定,3. 化学性质,与2，4-二硝基氟苯（DNFB）反应桑格反应 可用于鉴定多肽链的N端氨基酸DNFB 与-氨基反应 黄色,3. 化学性质,与异硫氰酸苯脂 (PITC) 的反应,可用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸， “多肽顺序自动分析仪”设计的原理根据。,3. 化学性质,与荧光胺
10、反应氨基酸与荧光胺反应生成具有荧光的产物，根据荧光的强度可以用荧光分光光度计测定氨基酸的含量。,3. 化学性质,.与5，5-双硫基-双（2-硝基苯甲酸）反应 该试剂又称llman试剂。半胱氨酸的的特有反应。412nm比色测定，可测半胱氨酸的含量。,有显著紫外吸收的氨基酸：Tyr 275nmPhe 257nmTrp 280nm,氨基酸的吸收光谱,是紫外法测定蛋白质含量的理论基础,蛋白质的特异吸收波长在 280 nm,氨基酸的紫外吸收光谱：,氨基酸的应用,1.医药工业2.化学工业3.食品工业4.农业5.化妆品工业,氨基酸输液-必需氨基酸治疗药剂精氨酸：对治疗高氨血症、肝机能障碍等疾病颇有效果；天冬
11、氨酸：钾镁盐可用于恢复疲劳；治疗低钾症心脏病、肝病、糖尿病等。半胱氨酸：能促进毛发的生长，可用于治疗秃发症；甲酯盐酸盐可用于治疗支气管炎等；组氨酸：可扩张血管，降低血压，用于心绞痛，心功能不全等疾病的治疗。,1.医药工业,2.化学工业,维生素B6:可采用丙氨酸或天冬氨酸为原料合成。 叶酸：需要用谷氨酸为原料合成。 氨基酸表面活性剂 聚合氨基酸：聚谷氨酸甲酯可用于作为合成皮革的表面处理剂；聚天冬氨酸或聚谷氨酸的二烷基酯与磷酸高级烷基酯结合得到化合物可作为可塑剂，稳定剂等。,营养强化剂； 谷氨酸钠味精； 天冬氨酸钠：可用于清凉饮料，能增加清凉感并使香味浓厚爽口； 天冬氨酰苯丙氨酸甲酯：甜味素APM
12、,3.食品工业,4.农业,杀虫剂：刀豆氨酸、5-羟色氨酸可使南方毛虫拒食而死；半胱氨酸可杀死黄瓜蝇；甘氨酸乙酯衍生的二硫代磷酸盐具有较强的杀蚜虫和杀螨效果； 杀菌剂：N-月桂酰缬氨酸可作为治疗稻瘟病；-1，4环己二烯丙氨酸能抑制黑穗病毒、稻瘟病等； 除草剂：如N-3,4二氮丙氨酸，硫代氨基酸酯等；,5.化妆品工业,氨基酸能调节皮肤pH的变动，对细菌的防护作用，也可作为皮肤、毛发的营养成分，增加皮肤、毛发的光泽。 防止皮肤干燥的自然保湿因子的主要成分是甘氨酸、羟基丁氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸等游离氨基酸。 在化妆品中添加天冬氨酸或其衍生物以及一些维生素，可防止皮肤老化。, 肽,（一） 谷胱甘
13、肽（GSH） （二） 催产素和加压素 （三） 促肾上腺皮质激素 （四） 脑肽 （五） 胆囊收缩素 （六） 胰高血糖素, 肽,一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物称为肽，氨基酸之间脱水后形成的键称为肽键，又称酰胺键。,立体结构,肽单位,（一）谷光甘肽（GSH）（二）催产素和加压素（三）促肾上腺皮质激素 （四）脑肽 （五）胆囊收缩素 （六）胰高血糖素,（一）谷光甘肽（GSH）,还原型,氧化型,（二）催产素和加压素,催产素,加压素,(三)促肾上腺皮质激素,(四)脑肽,(五)胆囊收缩素,(六)胰高血糖素,5 蛋白质的结构,（一） 蛋白质的一级结构 （二） 蛋白质的空间结构 （三）
14、蛋白质分子中的共价键与次级键,（一） 蛋白质的一级结构,一级结构 .指蛋白质中氨基酸 残基的排列顺序 包括二硫键的位置（肽键、肽链）,书写蛋白质肽链结构时,习惯上把肽链末端有-氨基的写在左边,称为N端或氨基末端,用H表示,另有-羧基末端的写在右边,称C端或羧基末端,用OH表示。,氨基酸残基：肽链中不完整的氨基酸单位,氨基酸残基,二硫键,肽链中还有二硫键,由肽链相应部位上两个半胱氨酸残基的-SH之间脱氢连接而成的,是连接肽链内或肽链之间的主要桥键,二硫键在蛋白质分子中起者稳定肽链空间结构的作用,往往与生物活力有关,生物体内起保护作用的皮角毛发的蛋白质的二硫键最多。,胰岛素是第一个被阐明化学结构的
15、蛋白质,蛋白质一级结构测定的原则,(1)测定蛋白质中氨基酸组成(2)蛋白质的N端和C端的测定(3)打开二硫键,分离肽链(4)应用两种或两种以上不同的水解方法将所要测定的 蛋白质肽链断裂,各自得到一系列大小不同的肽段.(5)分离提纯所产生的肽,并测定出它的序列.(6)从有重叠结构的各个肽的序列中推断出蛋白质中全部氨基酸排列顺序.(7)确定二硫键的位置,蛋白质的酶解,（二）蛋白质的空间结构,结构概述蛋白质的二级结构超二级结构和结构域蛋白质的三级结构蛋白质的四级结构胶原蛋白的构象,结构概述,蛋白质的空间结构构象，是以其一级结构为基础的。 酰胺平面： 20世纪30年代，Pauling和Corey用x-
16、射线衍射方法研究了氨基酸和肽的结构，得到了重要的结论：肽键的键长介于C-N单键和双键之间； 具有部分双键的性质，不能自由旋转； 肽键中的四个原子和它相邻的两个-碳原子处于同一平面，形成了酰胺平面，也称肽键平面 ； 在酰胺平面中C=O与N-H呈反式。,酰胺平面,多肽链的主链是由许多酰胺平面组成的，平面之间的碳原子相互隔开，并以碳原子为顶点作旋转运动，形成 二面角。,蛋白质的二级结构,蛋白质的二级结构主要是指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕方式。 天然蛋白质的二级结构主要有：(1)-螺旋结构(2)折叠结构(3)转角结构(4)自由回转,（1）-螺旋（-helice）,蛋白质分子肽主链上-碳两侧的Ca -
17、C键Ca-N键旋 转引起的主链围绕中心轴盘旋成的稳定的螺旋构象。,-螺旋结构链内氢键,-螺旋结构要点, 标准氨基酸： a.每圈3.6个氨基酸 b.每圈螺旋高度0.54nm (每个氨基酸0.15nm) C.每个氨基酸沿轴旋转 100度ns=3.613,螺旋,左手右两种螺旋多为右手螺旋,(1) -螺旋结构要点,在同一肽链内, 相邻的螺圈之间形成氢链。 -螺旋的稳定性主要靠链内氢键来维持。天然蛋白质绝大部分是右手螺旋，到目前为止仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一段左手螺旋 。,(2) 折叠结构（ - pleated sheet）,当-角蛋白用热水或稀碱等方法处理,或用外力拉直角蛋白就转变为-角蛋白,此时-螺
18、旋被拉长伸展开来,氢键被被破坏从而形成-折叠的空间结构. 它依靠相临肽链上的,与,形成的氢键以维持其结构 的稳定性。,折叠结构 （ - pleated sheet）,两个或多个几乎完全伸展的肽链平行排列；相邻肽链间通过 NH 与 C=O 形成规则的氢键；相邻 折叠层之间的距离约为 0.35 nm；相邻残基的 R 基团向着相反的方向；平行式（parallel）和反平行式（antiparallel）两种。,结构特点,折叠结构,例：丝心蛋白,折叠结构,有平行、反平行两种。从能量角度讲,反平行结构更为稳定。,反平行,平行,折叠结构,键垂直 于轴稳定,不稳定,(3) 转角结构,-转角是指蛋白质的分子的多
19、肽链经常出现180的回折，在回折角上的结构就称-转角，也称发夹结构。由第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的NH之间形成氢键。,-转角（ - turn） （-弯曲、 -回折、发夹结构）,(链内氢键),-凸起,在-股中额外插入一个氨基酸残基引起的。,通常作为反平行折叠片中的一种不规则情况而存在。,(4)自由回转,又称为无规则卷曲（random coil）,是指没有确定规律性的肽链构象，但仍是紧密有 序的稳定结构,许多蛋白质的功能部位常常埋伏在这里。,通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象。,超二级结构和结构域,(1)超二级结构(supersecondary structure) 若干相邻的
20、二级结构中的构象单元彼此相互作用,形成有规则的,在空间上能辨认的二级结构的聚集体。 已知的超二级结构主要有 ： ， ， 等。,超二级结构,超二级结构 是两个-螺旋 通过肽链连接 而成。,超二级结构,由一个不规则的 环链或 -helice 将两条平行的 -pleated 末端 以右手或左手交叉方式连接起来,曲折（ -meander） （ ）,-叠折 （- pleated sheet ）链逆转形成的发夹结构；,希腊钥匙拓扑结构 (Greek key topology),超二级结构和结构域,(2)结构域（ （structural domain） 结构域：是球状蛋白的折叠单位,多肽链在超二级结构的基础
21、上进一步绕曲折叠成紧密的近似球状结构。在空间上彼此分隔,各自具有部分生物功能的结构。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立的三维实体就称结构域。而对于较小的蛋白质分子或亚基结构域和亚基往往是一个意思,即这些蛋白质是单结构域的。,蛋白质的三级结构,蛋白质的三级结构是 指在二级结构基础上， 多肽链再进一步折叠盘 绕成更复杂的空间结 构，三级结构主要靠 非共价键来维持。,如肌红蛋白,四级结构的单元,蛋白质的四级结构,许多具有四级结构的蛋白质是由两个或两个以上独立的三级结构通过非共价键结合成的多聚体，称为寡聚蛋白。寡聚蛋白中的每个独立三级
22、结构单元称为亚基。,亚基是四级结 构的组成单元,蛋白质的四级结构,四级结构是指蛋白质的亚基聚合成大分子蛋白质的方式。亚基：是指一条多肽链或以共价链连接在一起的几条多肽链组成的蛋白质分子的最小共价结构单位。有的亚基已具有很小的生物活性，。当这些亚基聚合成一个完整的蛋白质分子后，即可具有生物活性。如图,蛋白质的最高级结构,血红蛋白四级结构示意图,蛋白质的最高级结构,四级结构的结构模型,四 级 结 构,两个亚基的结构,5.胶原蛋白的构象,胶原蛋白是动物体内最丰富的蛋白质,占有机体蛋白质总量的1/3.三条链，右手螺旋（每条左手）。三条链，右手螺旋（每条左手）主要分布在结缔组织、皮肤中 。,由结缔组织细
23、胞成纤维 细胞所分泌的结缔组织胶原 蛋白和某些上皮细胞分泌的 某些类型的胶原蛋白。分布 在骨、皮肤、血管壁、肌腱、韧带、肌肉、软骨、 角膜等。功能：是起着支架、维持组织构型、机体运动等多项作用。胶原蛋白,胶原蛋白,蛋白质分子一级结构是由共价键形成的,如肽键和二硫键。维持蛋白质构象的稳定性的化学键是次级键,包括氢键、盐键、疏水键、范德华引力等。,(三)蛋白质分子中的共价键与次级键,稳定蛋白质空间结构的化学键和作用力,1. 二硫键（disulfide bond）2.氢键（hydrogen bond）3. 盐键（ionic bond）4. 疏水相互作用（hydrophobic interaction
24、）5.Van der Waals 力,二硫键（disulfide bond）,二硫键的形成胰岛素 ( insulin),免疫球蛋白 (immunoglobulin）,蛋白质中的氢键,蛋白质分子在中的盐键,疏水作用,在水介质中，非极性基团趋于聚集，以减 少非极性基团与水的界 面，从而使蛋白质形成 疏水核心。是球状蛋白形成 稳定构象的主要作用力。,非特异性相互作用，存在于所有分子中及分子之间。,范德华力,6 蛋白质分子结构与功能的关系,(一)蛋白质一级结构与功能的关系1种属差异 2分子病 (二)蛋白质构象与功能的关系别构效应蛋白质的构象并不是固定不变的，当有些蛋白质表现其生物功能时，其构象发生改变
25、，从而改变了整个分子的性质，这种现象就称为别构现象，如血红蛋白在表现其输氧功能时的别构现象就是一个例子。,6 蛋白质分子结构与功能的关系,（一）蛋白质一级结构与功能的关系1种属差异 2分子病结构决定功能 （二）蛋白质构象与功能的关系别构效应,结构决定功能,（一）蛋白质一级结构与功能的关系,一级结决定高级结构,1.种属差异 P28 （一级结构改变，功能不变）胰岛素的51个氨基酸中有22个氨基酸是共有不变的,其他的可变。,（一）蛋白质一级结构与功能的关系,2.分子病,哪条链?错在哪?,由于Val取代了Glu，使Hbs链表面具有密集的疏水支链，这些疏水支链使Hbs分子集成长链，很多长链聚集成多股螺旋
26、，将红血球挤扭成镰刀状。如图所示,很多长链聚集成多股螺旋，将红血球挤扭成镰刀状。这种病在非洲的某些地区发病率较高。特点:相当一部分红血球呈镰形。如图所示,例2 一级结构的局部断裂与蛋白质的激活 体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制 肽，呈无活性状态，称为蛋白质原，其部分肽链 断裂后，才变为活性分子。 例：初合成的胰岛素为比成熟胰岛素 分子大一倍多的前胰岛素原，其N-末端有一段肽 链，称为信号肽。信号肽被切去，剩下的是胰岛 素原。胰岛素原比胰岛素分子多一段C肽，只有 当C肽被切除后才成为有51个残基，分A、B两条 链的胰岛素分子单体。,一级结构的局部断裂与蛋白质的激活,（二）蛋白质构象与功能
27、的关系别构效应,有些蛋白质表现其生物功能时，其构象会发生改变，从而改变了整个分子的性质，这种现象就称为别构现象。这是蛋白质表现其生物功能中的一种相当普遍而又十分重要的现象，如血红蛋白在表现其输氧功能时的别构现象就是一个例子（举例）。,蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，蛋白质的构象发生改变，也可影响其功能，甚至导致疾病。蛋白质构象改变导致疾病的机理： 蛋白质错误折叠聚集淀粉样纤维沉淀(抗蛋白水解酶、毒性)，致病。,蛋白质构象改变与疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨廷顿舞蹈症、疯牛病等。,疯牛病中的蛋白质构象改变 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protei
28、n, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的为PrPc （富含-螺旋），在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,7 蛋白质的性质,（一）、蛋白质的分子量 （二）、蛋白质的两性电离及等电点（三）、蛋白质的胶体性质（四）、蛋白质的沉淀反应（五）、蛋白质的变性（六）、蛋白质的颜色反应,是研究、分离检测的原理和依据,（一）蛋白质的分子量,蛋白质的相对分子量可以直接用沉降 系数表示。一般把单位（厘米）离心场里的 沉降速度称为沉降系数。沉降系数：用S表示。一个S单位：为110-13秒,810-13秒用8S表示。超速离心机最初是Svedberg于1940年设 计制造的。
29、,（二）蛋白质的两性电离及等电点,与氨基酸相似，蛋白质也有等电点,等电点时的 特点也基本与氨基酸相同（净电荷为零、溶解度最 小、 易沉淀析出）。该性质常在蛋白质的分离提纯时应用。蛋白质也是带电的颗粒，因此有电泳现象。电泳：带电的胶体颗粒在电场中向电荷相反的电 极移动。,蛋白质在溶液中解离,电泳的基本原理概述,带电的蛋白质分子在电场中朝着与自己所带电荷相反的方向移动，根据各种蛋白质分子的移动速度不同，对各种蛋白质进行分离。,电泳结果,电泳设备,蛋白质分子质量大，在水溶液中的颗粒具有胶体溶液的特征: 布朗运动、丁道尔现象、电泳现象(电泳)，不能透过半透膜(透析)以及具有吸附能力(层析)等。可以利用
30、这些性质进行分离提纯。,（三）蛋白质的胶体性质,不能透过半透膜 透析法： 可用羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等半透膜来分离纯化蛋白质。 吸附法： 蛋白质颗粒在溶液表面较大，表面有极性和非极性基团，因此对许多物质都有吸附能力。一般极性基团易与水溶性物质结合，非极性基团易与脂溶性物质结合（相似相溶原理）。如吸附层析法。,蛋白质溶液是胶体溶液（如血清、蛋清）胶体条件：1.大小：1-1002.有水膜：表面有许多极性、亲水基团 (-NH3、-COOH、-OH、-SH、-CONH2等）。 3.带相同的电荷（同性相斥）,破坏了蛋白质的水膜(水化膜)或中和了蛋白质的电荷。,为什么蛋白质 会发生沉淀？,（四）蛋白质的沉
31、淀反应,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,能使蛋白质产生沉淀的试剂1、加高浓度盐2、加有机溶剂3、加重金属盐4、加某些酸类,1.加高浓度盐类 盐析法（可逆）：盐既是电解质又是脱水剂如硫酸铵（水中溶解度大，最常用）、硫酸钠、氯化钠等,破坏蛋白质胶体周围的水膜，又中和了蛋白质分子的电荷。盐析法是分离制备蛋白质的常用方法。优点:蛋白质不变性，保持生物活性，安全。,2.加重金属盐 如氯化高汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化等。 原因：蛋白质在碱性溶液带负离子中，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀（不可逆）。重金属作业的人应吃高蛋白食物，降低对重金属机体的吸收，补充蛋白质能缓解重金属盐中毒（沉淀不易吸
32、收）。,3.加有机溶剂 与水互溶的有机溶剂酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀。 原因：与水有较强的作用，脱掉了蛋白质分子周围的水膜，增加了蛋白质分子之间的静电作用而沉淀。但要防止条件太激烈（如温度偏高、作用时间太长）。,4.加某些酸类 加苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。 （“柿石症”是空腹吃大量的柿子，其中的单宁酸使肠胃中的蛋白质凝固变性形成柿石）。,（五）蛋白质的变性,蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。,蛋白质的主要变性
33、因素： 物理因素：加热（70-100）、剧烈振荡或搅拌、超声波等。 化学因素：强酸、强碱、尿素等。 （如酶失去催化能力等）。变性和沉淀的区别:沉淀不一定变性,而变性基本沉淀. 狭义的沉淀指不变性沉淀.,变性蛋白质主要标志：生物功能的丧失。,变性的其他表现： 溶解度降低，易形成沉淀析出、结晶能力丧失，球状蛋白形状发生改变、肽链松散 反应基团增加，从而易被蛋白水解酶消化。 因此一般认为天然蛋白质在体内消化的第一步就是蛋白质的变性。生物机体衰老和蛋白质变性有关亲水性减弱。 如老肉难烂, 陈旧种子不发芽等。,蛋白质的复性： 变性条件不过于剧烈，蛋白质分子的内部结构变化不大,变性是可逆的，消除变性条件活
34、性可以恢复。这说明蛋白质分子的内部结构变化不大。但随着变性时间的增加，条件加剧，变性程度也加深，这样就达到不可逆的变性。,（六）蛋白质的颜色反应,1、双缩脲反应 2、米伦氏反应 3. 乙醛酸反应 4、坂口反应 5、酚试剂（福林试剂）反应,1、双缩脲反应,双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到180，则两分子尿素缩合成一分子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络和物，此反应称双缩脲反应。,2、米伦氏反应,米伦试剂：为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液。 蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。 酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，
35、故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应.,3. 乙醛酸反应,在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环，凡含有吲哚基的化合物都有这一反应。色氨酸有此反应。,4、坂口反应,精氨酸分子中含有胍基，能于次氯酸钠及- 萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物.,Arg + 次氯酸钠 + -萘酚 红色,5、酚试剂（福林试剂）反应,蛋白质分子一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物。,8 蛋白质的分类,（一）简单蛋白质分子只由氨基酸组成 （二）结合蛋白质结合蛋白质是由简单蛋白质和非蛋白质两部分组成，其非蛋白质部分通常称为辅基,结合蛋白质（
36、conjugated protein）,结合蛋白质是由简单蛋白质和非蛋白质两部分组成，其非蛋白质部分通常称为辅基。根据辅基不同。结合蛋白质可分为5类：1、核蛋白（ribonucleoprotein）2、糖蛋白（glycoprotein）与蛋白聚糖3、脂蛋白（lipoprotein）4、色蛋白（chromoprotein）5、磷蛋白（phosphoprotein）,1.核蛋白（ribonucleoprotein）,由蛋白质与核酸组成。它存在于细胞核中,由脱氧核糖核酸与组蛋白结合而成。已知的病毒都是核蛋白。,2.糖蛋白（glycoprotein）与蛋白聚糖(Proteoglycan),两者都是由蛋
37、白质和糖以共价键相连而成。,糖蛋白的功能P37（提问）： 酶、运载蛋白、抗体、激素、血型物质、 信息分子、结构蛋白等。,*糖蛋白寡糖链的功能,参与新生肽链的折叠并维持蛋白质的正确的空间构象；影响亚基聚合；糖蛋白在细胞内的分拣和投送。保护糖蛋白不受蛋白酶的水解，延长其半衰期。 参与分子的识别作用细胞间与细胞和 细胞外基质 的 粘附（见图）：,*(4)蛋白聚糖的功能,构成细胞外基质 在基质中蛋白聚糖和弹性蛋白、胶原蛋白以特殊方式连接，构成基质的特殊结构。这与细胞的粘附、迁移、增殖和分化等有关。,其它功能 抗凝血（肝素） 参与细胞识别与分化（细胞表面的硫酸素） 维持软骨机械性能（硫酸软骨素）等,2.
38、脂蛋白（lipoprotein）,由蛋白质和脂类通过非共价键相连而成，存在于生物膜和动物血浆中。脂蛋白的蛋白质部分称脱辅基蛋白，又称载脂蛋白。 血脂不溶于水，在血浆中和载脂蛋白（apoprotein, Apo）组成脂蛋白（lipoprotein, Lp）的形式转运成熟血浆脂蛋白呈球状，其核心组分为甘油三脂 和胆固醇脂，表面组分为载脂蛋白、游离胆固醇和磷脂 。,血 浆 脂 蛋 白 颗 粒 的 结 构,LDL,3.色蛋白（chromoprotein）,由蛋白质和色素组成。 色蛋白种类很多，其中以含卟啉类的色蛋白最为重要（血红蛋白、Cytc等）。,4.磷蛋白（phosphoprotein）,由蛋白质
39、和磷酸组成（胃蛋白酶、酪蛋白酶）。通常磷酸与丝、苏氨酸侧链的-OH相连。,其他分类方法： 蛋白质按功能分类：催化、调节、运输、贮存、运动、防御、受体、毒蛋白、膜蛋白等。按形状分类纤维蛋白质球蛋白,9蛋白质的分离与纯化(一)蛋白质纯化的总目标增加制品的纯度，即设法除去变性的和不需要的蛋白质。单位蛋白质重量中所需蛋白质的含量或生物活性。(二)分离纯化蛋白质的程序：前处理（细胞或组织处理）粗分级分离（除去杂蛋白）和细分级分离。利用蛋白质的各种性质进行分离纯化； 尽量避免蛋白质的变性因素，保持蛋白质结构的完好和生物活性（分不同需要）,粗提： 盐析 结晶 有机溶剂沉淀 等电点沉淀精提 ： 离心（cent
40、rifugation） 电泳（electrophoresis） 层析（chromatography）,盐析法：加入大量的中性盐，脱去水化层而沉淀,有机溶剂沉淀法：加入极性的有机溶剂如甲醇等，脱去水化层并增加质点间的相互作用而沉淀,重金属盐沉淀法：当pH大于等电点时，蛋白质颗粒带净负电荷，易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀,生物碱或酸类沉淀法：当pH小于等电点时，蛋白质颗粒带净正电荷，易与生物碱或酸根负离子结合成不溶性盐而沉淀,加热变性沉淀法：蛋白质因加热变性而凝固,蛋白质沉淀法,利用蛋白质的胶体性质：,蛋白质的分离纯化依据,分子大小,溶解度,电荷,吸附特异亲和力,其它,蛋白质的分离纯化方法透析
41、和超过滤分子大小 密度梯度离心凝胶过滤,溶解度,等电点沉淀和pH控制,盐溶和盐析,有机溶剂分级分离法,温度沉淀,利用分子大小分离 透析和超过滤： 利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离； 密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。,凝胶过滤： 即分子排阻层析。 凝胶颗粒内部为 多孔的网状结构。 大分子最先流出 层析柱。,溶解度 等电点沉淀和pH控制 盐溶和盐析:中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。原因是蛋白质分
42、子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当离子强度增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的自由水被移去以溶化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀。 有机溶剂分级分离法:一是降低介质的介电常数，二是与蛋白质争夺水化水。 温度沉淀:温度对溶解度有影响，低温稳定，高温不稳定。在040，大部分的球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。,蛋白质分离纯化方法电泳:利用净电荷、分子大小、形状的差异。离子交换层析等电聚焦：外加电场时，蛋白质混合物在具 电荷 pH梯度的介质中移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH处，形成区带。层析聚焦：层析柱中建立连续的pH梯度，
43、蛋白质样品 由柱上端随缓冲液的展开而聚焦在各自的等电点 pH处，形成区段。（其他方法如下）,吸附：吸附层析，吸附剂（硅石、氧化铝、活性碳）和疏水吸附剂，与待分离分子和杂质分子的吸附与解吸能力不同。特异亲和力：亲和层析其它：如高效液相层析（HPLC）,快速蛋白液相层析（FPLC）,Ala Leu Pro Lys Asp,五种标准氨基酸及其混合纸层析图谱,混合,血红蛋白和核黄素逐渐分离(凝胶过滤层析）,电泳（electrophoresis）,层析（chromatography）,原理：溶液中的分子能 与固体表面进行结合及解 离，但由于蛋白质在分子 量、带电性和结合特异性 方面的差异，与固体表面 结合与解离的难易程度不 一样，所以流动的速度也 不一样。固定相由圆球形小珠密 堆积而成。这些小珠的性 质决定了可以分离哪种成 分,蛋白质的定性、定量分析以显色反应为主，如茚三酮、双缩尿反应等。K氏定氮法紫外吸收法(280nm),
