1、,第二章蛋白质(protein)(2)氨基酸与蛋白质的一级结构,（四） 毛细管电泳毛细管电泳技术是将养品点在装有凝胶的、直径为20-75 m 内经的毛细管里，进行电泳。优点是分辨率高、样品需要量小。电泳速度快、上样和分离物的检测都能够进行自动化操作。因为毛细管散热性能好，允许使用很高的电压进行电泳。除分离检测蛋白质外，在核酸的序列分析中使用较为普遍。,（五）电泳后的蛋白质检测：考马斯亮蓝染色是常用的一项电泳染色方法,是根据考马斯亮蓝能与蛋白质多肽链定量结合的原理而建立起的。对于一个混合蛋白质的电泳分离来说,它只能检测样品的分离情况；如果被检蛋白质的位置可以确定,可以将该蛋白质的色带切下之后进行
2、脱色,测定脱色液光吸收值,能对该蛋白质进行定量分析。,活性染色：根据有活性的目标蛋白质特有的生物化学反应产生的有色物质或另外加入某种能与产物生成颜色的物质来进行检测的.活性染色可以从一个复杂的蛋白质样品中检测到目标蛋白出现的位置。活性染色法在同工酶(例如酯酶同工酶、谷氨酸脱氢酶同工酶、谷氨酰胺合成酶同工酶等)的检测中非常有用。,免疫印迹(Immunoblotting)或蛋白质印迹(Western blotting)是检测目标蛋白质的一项十分有效的方法。一种蛋白质(抗原)能与它产生的抗体专一地反应。在电泳之后,欲检测目标蛋白的存在,可以先将凝胶中的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上,然后用目标蛋白产生
3、的抗体与之产生抗原-抗体反应,最后可用连接有碱性磷酸酯酶或辣根过氧化酶的第二抗体(通用抗体)与第一抗体反应,加入能与抗体共接的酶反应生成有色物质的生色液,即可十分可靠地检到的目标蛋白。,七 蛋白质的沉降作用及超离心分离沉降速度( = dx / dt )与蛋白质分子的大小和密度有关。沉降速度法，适用于分离沉降系数不同但密度相近的蛋白质。沉降平衡法，适用于沉降系数相近，但密度不同的蛋白质。 沉降系数：当沉降界面以恒定的速度移动时，单位离心场里的沉降速度。,用离心法分离细胞亚微结构,差异（速）离心：用不同的离心速度、依据被分离物的大小而将细胞亚结构彼此分离的效果。速度区带离心：将样品铺在稀的蔗糖溶液
4、的顶层，溶液不用于分离而用以抗对流作用，离心完成后，细胞各成分以其大小不同而在离心管中呈区带分布，若离心时间太长，或离心力过大，细胞各成分都会沉降至管底，而达不到分离效果。,600g,3 min.上清,6000g,8 min.上清,40000g.30 min.上清,100000g.90 min.上清,沉淀：细胞核,沉淀：线粒体，叶绿体，溶酶体，过氧化酶体,沉淀：细胞质膜，高尔基体和内质网膜的碎片,沉淀：核糖体亚基,细胞液,差异（速）离心法,平衡密度梯度离心：用不同的离心速度、依据被分离物的密度而进行分离的效果；通常是将没有纯化的物质铺在密度溶液（如蔗糖溶液，氯化铯溶液为介质，离心管内的溶液密度
5、从底部到顶部是浓至稀的梯度）的顶层，通过离心（160000g，3h）细胞内各成分不停地下沉分别达到与溶液的密度相等时的位置。其介质的密度范围宽于被分离组分的密度。,差异（速）离心与平衡密度梯度离心法,第五节 蛋白质的一级结构和测定 （一）蛋白质一级结构概述蛋白质的结构层次：一级结构(primary structure)：多肽链内氨基酸残基从N端到C端的排列顺序，或称氨基酸序列。 二级结构（secondary structure）：多肽链主链不同肽段沿主轴盘旋折叠而形成的空间结构。二级结构是蛋白质结构的构象单元。主要有螺旋、折叠、转角、无规卷曲。,三级结构（tertiary structure）
6、：多肽链在二级结构基础上进一步卷曲折叠，即整个肽链（亚基）的空间形状。三级结构指的是处于充分折叠、具有生物学活性的一个完整的球蛋白的三维结构， 。四级结构（quaternary structure）：寡聚蛋白质分子亚基之间的相互关系和空间位置。,蛋白质测序的一般步骤：首先目标蛋白质分离纯化得到高度纯净的蛋白质样品。 （1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目，末端分析，分析多肽链的N末端和C末端。 （2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。断裂链内二硫键。（3） 测定多肽链的氨基酸组成，酸水解或碱水解。（4） 多肽链部分裂解成肽段，专一性酶解。（5） 测定各个肽段的氨基酸顺序。（6） 确定肽段在多肽链中的顺
7、序。 （7） 确定多肽链中二硫键的位置。,二 蛋白质一级结构测定,目标蛋白质的分离纯化程序主要包括:,1 材料的选择；2 组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液；3 蛋白质初步提纯；4 选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化；5 目标蛋白的鉴定。用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白质的整个分离纯化过程中要在较低温度下(04)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。,（一） 氨基酸的组成分析 蛋白质在标准条件下经酸水解后, 进行氨基酸的组成分析.通过组成分析基本上可推测出部分水解所产生的肽碎片的数目。 （二）末
8、端分析(确定蛋白质的肽链组成) ：通常测定肽链的N-末端. 二硝基氟苯(DNFB)法 或丹磺酰氯（DNS-Cl）法是常用的方法。丹磺酰氯为一种更有效的试剂，灵敏度比DNFB法高100倍。,丹磺酰氯分析多肽链的N末端,水解多肽确定氨基酸组成,确定N末端的氨基酸残基,苯异硫氰酸酯（PITC）Edman试剂,确定N末端的氨基酸残基 剩下的多肽可以再利用。,（三）拆开链间或链内的二硫键 （1) 还原法：用巯基乙醇(HSCH2CH2OH)或二硫苏糖醇等还原性试剂使二硫键打开，还原生成-SH。（2)氧化法：常用过甲酸(CHOOOH)作为氧化剂，使二硫键氧生成半胱氨磺酸(磺基丙氨酸残基) 。,（四）肽链的部
9、分水解 常用胰蛋白酶法, 胰凝乳蛋白酶法和溴化氰法等方法。下面是一个典型的多肽，用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶 (糜蛋白酶)和溴化氰分别处理所得到的结果： AlaArgArgMetPheAlaLysAsp-Phe-Leu-Lys胰酶处理： 凝乳蛋白酶处理： 溴化氰处理：Ala-Arg Ala-Arg-Arg-Met-Phe Ala-Arg-Arg-MetArg Ala-Lys-Asp-Phe Phe-Ala-Lys-Asp-Phe-Leu-LysAsp-Phe-Leu-Lys Leu-Lys Met-Phe-Ala-Lys,过甲酸,巯基乙醇,碘乙酸,酶法裂解,胰蛋白酶 R1 =Lys或Arg （高度
10、专一,水解速度快）R2 =Pro 不能水解 胰凝乳蛋白酶 R1 =Tyr、Trp、Phe（水解速度快）；Leu、Met或His（水解速度缓慢）R2 =Pro 不能水解 胃蛋白酶 R1 和R2 =Phe、Trp、Try、Leu和其它疏水性氨基酸。 嗜热菌蛋白酶 R2= Leu Ile Phe、Trp、Try Val或 MetR2 =Pro 或Gly不能水解 Pro蛋白酶 ProX溴化氰： R1 = Met （高度专一,水解速度快）,（五）肽碎片的氨基酸顺序分析： Edman降解法：专用试剂是苯异硫氰酸。羧肽酶法： 羧肽酶 A：从C-末端依次降解末端残基，含芳香环的或脂肪烃基较大的残基易被水解。但
11、该酶不能水解C-末端的 Arg、Lys 和Pro。羧肽酶 B能专门水解C-末端的 Arg 和 Lys，对其它残基不起作用。如果C-末端第二个残基是Pro，则酶 A 和酶 B 都不起作用。羧肽酶 C能水解C-末端的 Pro.（六）片断重叠确定整个肽链的氨基酸顺序： 胰酶：Ala-Arg Arg Met-Phe-Ala-Lys Asp-Phe-Leu-Lys 糜酶：Ala-ArgArg-Met-Phe Ala-LysAsp-Phe Leu-Lys 全顺序Ala-ArgArg-Met-Phe-Ala-LysAsp-Phe-Leu-Lys,例：用胰蛋白酶处理某多肽后获得一个七肽（非羧基端肽）。这个七肽
12、经盐酸完全水解后获得Met、Glu、Phe、Ala、Pro、Lys、各1 mol。该肽与二硝基氟苯反应后用盐酸水解不能得到任何DNP氨基酸。该肽用羧肽酸B处理不能得到任何更小的肽。该肽用CNBr处理得到一个四肽和一个三肽，四肽经酸水解后得到Met、Phe和Glu。这个七肽经糜蛋白酶处理也得到一个三肽和一个四肽，四肽的氨基酸组成是Ala、Met、Pro和Lys。根据上述信息确定这个七肽的氨基酸顺序。,1 胰蛋白酶作用某肽得到非羧基端肽，说明这个肽段的羧基端残基是赖氨酸。七肽经酸水解得到Met、Glu、Phe、Ala、Pro、Lys、各1 mol，说明Trp被破坏。 2 该肽与DNFB反应后，酸水
13、解得不到任何DNP-aa.说明该肽 的N端为Trp。 3 羧肽酶B作用，不能得到更小的肽说明，C端倒数第二个为Pro。Trp-Pro-Lys 4 溴化氰作用得到四肽，Met，Phe和Glu，说明四肽为Trp-（Glu，Phe）-Met三肽为 Ala-Pro-Lys 5 胰凝乳蛋白酶处理得到三肽和四肽，四肽为Ala ，Met， Pro， Lys。显然三肽的顺序为Trp-Glu-Phe，四肽的顺序为 Met-Ala-Pro-Lys七肽的顺序为：Trp-Glu-Phe- Met-Ala-Pro-Lys,（七）间接方法测定蛋白质的一级结构：测定蛋白质基因的顺序可推测蛋白质一级结构。由于近年来DNA的序
14、列测定相对比较容易，采用测定编码该蛋白质的基因序列来推断蛋白质一级结构，这种方法适用于组织中含量低纯化比较困难的蛋白质，其前提条件就是要能够得到编码该蛋白质的基因。 （八）数据库提供不同蛋白质顺序的信息在测定一种蛋白质的氨基酸顺序后，按照惯例该蛋白质的顺序信息就进入到数据库中这些数据以及其它更专门化的内容可经World Wide Web访问，从而了解到你所需要的有关数据。,三 蛋白质与生物进化 （一） 蛋白质一级结构与生物进化 以胰岛素和细胞色素c为例说明。示出了细胞色素c 种系发生树。1 序列比较提供蛋白质结构与功能的信息 同源蛋白质 (homologous proteins)进化上相关的蛋
15、白质，换句话说，来源不同的同一种蛋白质，例如细胞色素C、胰岛素，在不同生物体内存在的的同一种蛋白质。,2 序列比较揭示进化上的关系细胞色素c存在所有需氧生物种类的细胞中，该蛋白质在分子水平上提供了从进化上比较生物的一个非常好的范例。种属越近氨基酸残基序列的相似性就越大。（二）基因复制和蛋白质家族相似功能的蛋白质具有相似的氨基酸序列。基因复制是进化的一种特别有效的方法，因为一个基因拷贝通过自然选择进化出新的功能。,四 完全不同的蛋白质可能来自同一个祖先母鸡卵清蛋白和人乳乳清蛋白之间的序列同源性比较，表明这两种生物活性和起源完全不同的蛋白质，两者之间有48个位置的氨基酸残基相同，三级结构非常相似。来自不同生物体内结构功能相似的蛋白质，可能就是同源蛋白。因为它们来自同一个祖先基因。五 蛋白质一级结构的个体差异血红蛋白（hemoglobin,Hb）分子病分子病是遗传疾病-镰刀状细胞贫血病血红蛋白异常由基因突变引起，并通过遗传在群体中散布。,利用电泳比较了HbS(镰刀状细胞贫血病)与正常的成熟的血红蛋白（HbA）。结果表明Hb S比Hb A带有的正电荷多，后来序列分析发现，HbS分子中的链的第六个氨基酸残基是一个非极性的缬氨酸，而正常的HbA分子中的链的第六个氨基酸残基是谷氨酸，这一替换是由编码链的基因中的单个核苷酸取代引起的。,正常红血球,镰刀形红血球,
