1、中药鉴定学的新技术与新方法,汪哲宇 钟隆洁 吴佳佳2016.10.14,目 录,性状显微鉴定技术,化学鉴定技术,分子鉴定技术,分子鉴定技术,分子鉴定技术,核酸分子鉴定,蛋白质分子鉴定,基于序列分析,抗血清鉴定,飞行时间质谱鉴定,电泳鉴定,同工酶鉴定,直接测序,基于PCR,基于分子杂交,PCR-RFLP,条形码技术,位点特异性PCR,RAPD,AFLP,SCAR,SSR,RFLP,DNA芯片,分子鉴定技术,分子鉴定技术,1. DNA条形码鉴定技术,定义：生物体内能够代表该物种的、标准的、 有足够变异的、易扩增且相对较短的 DNA片段。,DNA条形码鉴定技术,在中药鉴定中的应用,以ITS2序列为核
2、心、psbA-trnH为补充序列的DNA条形码鉴定体系,植 物,以COI序列为核心、ITS2为补充序列的DNA条形码鉴定体系,动 物,DNA条形码鉴定技术,信息量大且相对稳定,ITS2序列（internal transcribed spacer 2）,鉴定速度快，可批量鉴定,对鉴定材料要求较低,分子鉴定技术,2. 位点特异性PCR鉴定技术,待鉴定种（变异性位点一）,伪混品（变异性位点二）,3,3,3,3,5,5,5,5,3,3,5,5,3,5,3,3,5,5,3,5,引物,引物,PCR,PCR,可扩增,不可扩增,位点特异性PCR鉴定技术,关键点,获得种内稳定的碱基变异位点,鉴定引物的设计,在中
3、药鉴定中的应用,流苏石斛,蕲蛇,东方泽泻,分子鉴定技术,3. 序列特异性扩增鉴定技术（SCAR）,a. RAPD标记分析,b. RAPD特异片段回收、克隆及测序,c. SCAR标记的建立,3,3,5,5,3,3,5,5,A,B,随机引物PCR扩增,聚类分析,A类,B类,进一步筛选,特异性条带F300,3,5,5,3,克隆，测序,回收,TTCAGGGCAC,设计特异引物,5,3,对A和B进行扩增,3,3,5,5,A,5,3,3,3,5,5,B,5,3,可扩增,不可扩增,RAPD标记 成功转化为 SCAR标记,参考文献,1 王川易、郭宝林、肖培根.中药分子鉴定方法评述 J. 中国中药杂志,2011
4、,36(3):237-240.,2 陈士林、郭宝林、张贵君等.中药鉴定学新技术新方法研究进展J. 中国中药杂 志,2012,37(8):1043-1045.,3 费希同、巨苗苗、林源等.ITS2序列在植物DNA条形码鉴定中的应用J. 亚热带植物科 学,2014,43(4):339-342.,4 田孟良、官宇、刘帆等.基于RAPD标记的SCAR分子标记技术鉴定川牛膝及其混淆品 J. 中国中药杂志,2010,35(8):953-955.,5 Li X X , Ding X Y , Chu B H , et al. Molecular authentication of Alisma orienta
5、le by PCR-RFLP and ARMS J. Planta Med,2007,73(1):67.,6 Lu S, Ding X Y , Han L , et al. Confirming the genetic identity of Dendrobium fimbriatum using an Amplication Refractory Mutation Systems(ARMS) J. PI Mol Biol Rep,2010,doi:10.1007/s11105-010-0190-4,化学鉴定技术,化学鉴定技术,光谱鉴定技术,色谱鉴定技术,红外光谱鉴定技术,HPLC鉴定技术,G
6、C鉴定技术,HPCE鉴定技术,拉曼光谱鉴定技术,X-射线衍射图谱鉴定技术,化学鉴定技术,色谱|光谱联用,HPLC-MS鉴定技术,其它色谱-光谱联用技术,光谱鉴定技术,1. 红外光谱鉴定技术,原理：不同的化学键或官能团吸收频率不同，在红外光谱上将处于不同位置，可获得分子中化学键或官能团的信息,近红外区(0.752.5 m)、中红外区(2.525 m)和远红外区(25300 m),化学鉴定技术,优势,局限性,存在谱图影响因素多、背景复杂、谱峰重叠等限制,近缘物种可能在图谱总体特征上变化较小,不同的采收、加工、处理等可能较大影响药材总体成分变化,仪器通用，操作简便，成本低，无污染，重复性好,实现各种
7、形态样品的快速、无损检测，样品可无需分离提取等预处理,反映样品的整体化学信息,光谱鉴定技术,2. 拉曼光谱鉴定技术,原理：对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。,八角茴香及其伪品的拉曼谱,八角茴香,莽草,光谱鉴定技术,3. X-射线衍射图谱鉴定技术,原理：X-射线衍射图谱为X-射线受到原子核外电子的散射而发生的衍射，而不同原子排列的晶体会产生特定的衍射图像( 图谱) ，一般用于推测晶体结构。中药材的 X-衍射图谱应为其所含各种成分中所有原子的衍射图谱叠加后构成的特征图谱。,山栀子X-射线衍射图谱,色谱鉴定技术,1. HPLC鉴定技
8、术,高效色谱鉴定技术：以液体为流动相，采用高压输液系统，将不同极性流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，利用梯度洗脱技术可将药材中的各类成分分离结果表征为一张色谱图。,色谱鉴定技术,2. GC鉴定技术,GC （气相色谱法）主要是根据不同化合物在固定相和气体流动相之间的分配不同进行分离分析的手段，适用于气体、挥发性和半挥发性液体以及能够产生足够蒸气压固体的分析。,GC 指纹鉴定是针对中药中可挥发性且热稳定性的药材化学成分,色谱鉴定技术,3. HPCE鉴定技术,HPCE （高效毛细管电泳）是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离分
9、析的液相分析方法。,色谱-光谱联用鉴定技术,色谱-光谱联用鉴定技术是具高效分离性能的色谱技术与能获取化学成分丰富结构信息的光谱技术相结合形成的系列中药鉴定技术,HPLC-MS 联用技术，利用质谱进行成分的检测和解析，提高了传统检测器灵敏度和选择性，可对中药样本中未知化学成分进行定性、初步确定未知化学成分的化学结构。GC-MS 是目前分析和鉴别具有挥发性、半挥发性成分中药的首选技术 GC-FTIR 联用可分离、鉴定各类复杂混合物，实现中药鉴别,性状显微鉴定技术,性状显微鉴定技术,仿生识别鉴定,其他鉴定,偏光显微镜鉴定,电子显微镜鉴定,体视显微镜鉴定,嗅觉仿生,味觉仿生,视觉仿生,嗅觉仿生技术是动
10、物嗅觉系统研究成果、传感器技术与电子学和计算机技术结合的产物，模仿人类后脑部嗅上皮细胞的工作模式，实现对气味的检测。,嗅觉仿生,味觉仿生技术是模仿人类味觉细胞和受体传感的工作模式，实现对液体“味道”的检测。,味觉仿生,视觉仿生是一种基于仿人眼视觉特性的视觉检测和目标识别体系结构及感知计算模式。,视觉仿生,性状显微鉴定技术,1、仿生识别鉴定,嗅觉仿生,性状显微鉴定技术,性状显微鉴定技术,八角,白豆蔻,川芎,防风,柴胡,当归,嗅觉仿生,味觉仿生,性状显微鉴定技术,味觉仿生,性状显微鉴定技术,苦味传感器,咸味传感器,视觉仿生,性状显微鉴定技术,色差计,1931年国际照明委员会规定了标准观察者的光谱三
11、刺激值：照明、色度、饱和度。,视觉仿生,性状显微鉴定技术,黄学思，李文敏，张小琳，等基于色彩色差计和电子鼻的槟榔炒制火候判别及其指标量化研究J中国中药杂志，2009，34( 14) : 1786.,沈昱翔丹参药材形态特征与质量的相关性研究D成都:成都中医药大学，2011.,性状显微鉴定技术,2、偏光显微镜鉴定技术,偏光显微镜又称偏振光显微镜。在普通光学显微镜中增加偏振装置。偏振光在通过各向同性的物质时呈现暗视野，而各向异性的样品呈现不同的测试片。非均质性的晶体或某些分子排列无序的有机物则会呈现出颜色不同，强弱不一的光彩。,性状显微鉴定技术,3、电子显微镜鉴定技术,康廷国，纪俊远，王金萍，等.
12、四种洋金花的显微鉴定J中药通报，1987，12( 12) : 12.,性状显微鉴定技术,4、体视显微镜鉴定技术,胡东维，蒋选利，姚雅琴，等. 十字花科十九种种皮微形态学研究J 西北农业大学学报，1992，22( 1) : 61.韩荣兰，张奠湘，郝刚，等. 中国桑寄生科植物叶表皮微形态J 广西植物，2004，24( 5) : 426.吕洪飞，许常丹，邵邻相，等. 紫茎泽兰器官表面微形态的观察J 电子显微学报，2005，24( 2) : 157.,性状显微鉴定技术,5、其他鉴定技术,中药材三维组织结构的重建技术中药微性状系统鉴定法新型微形态特征发掘,测试了中草药艾迪注射液和复方苦参注射液的抗癌特性,一种细胞阻抗传感器,一种细胞阻抗传感器,一种细胞阻抗传感器,一种细胞阻抗传感器,细胞-电极阻抗模型,利用Zveiw拟合模型所得各参数,Zview软件界面,THANKS,
