1、功能基因的序列比对.切除载体和(或) 引物a.打开所有的原始引物序列于一个 EditSeq 的窗口中b. export all as onec.保存d.打开这个保存的文件，开始切除载体和引物e.选择载体插入点两侧的序列(10-15 个的样子) 搜索 注意：不存在正反向的问题，都是一个方向，因为测序的时候是选择两个载体上的引物其中的一条来往后测序的！ 切完之后另存为f. 重新打开这个文件，开始切除引物方法同切载体，但是要注意正反向的问题。比如 mcrA 基因，其引物为Forward: 5-GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC-3Reverse: 5-TTCATTGCR
2、TAGTTWGGRTAGTT-3先找 Forward 5端，此时只找到的部分序列。切去 5端。然后再切这些切掉 5端序列的 3端的序列，此时其 3端序列应该是 Reverse 的反向互补序列。切去这个反向互补序列，这样一来这个些序列就已经被切去两端的引物了。但此时还剩下另一部分未切除任何引物的序列，此时记下这些序列的编号，先切去 Reverse 5端。再用 Forward 的反向互补序列切去 3端，这样剩下的序列也都被切除两端的引物了。将所有序列调整为同向序列：a. 选择前面记录编号的序列，将这些序列一个个都转换为其反向互补序列。这样一来所有的序列都成为同向序列了，即在 DNA 两条反向互补链
3、的其中一条上的比较了。b. 保存该文件生成 OTUsGoogle 搜索”Fastgroup II”或 http:/fastgroup.sdsu.edu/fg_tools.htm(Online grouping-注意勾选的选项)Choose method 里面相似度可以选 97%或 98%提交之后出现的窗口如可以看到被分为了 10 个 OUT 每个 OUT 都自动选择了一个代表序列。全选将其复制到word 中，备用。并把其中的那些代表序列都复制下来粘贴到 TXT 保存。寻找嵌合体: 一般是对 16S rRNA 来说的两个网站：http:/decipher.cee.wisc.edu/FindChi
4、merasOutputs.html (或搜 decipher chimera)http:/comp-bio.anu.edu.au/bellerophon/bellerophon.pl (或搜 bellerophon chimera check)翻译网站：http:/pfam.sanger.ac.uk/在保存有 OTUs 的 TXT 文件中，一个一个翻译成蛋白质序列。最后保存。在用 Expasy 翻译的时候选择第二个选项点击翻译理想的情况是这段序列中应该是没有终止序列的即”-”符号，因此先选择阅读框较长，整段序列也没有终止子的那些，如图，先选择第二个。复制红色的区域，在 blast 上比对，看是
5、否是需要的序列，如果是。那么就选择此结果，如果不是，再一一比对其他的罗列结果。或者直接将 DNA 序列提交到 sanger 上，出现如下结果Frame2 中有一段绿色，显示就是 mcrA 的保守家族。那么 Frame2 即为正确的翻译方法。另存为，只保留 pro 的序列的 TXT改名为.FAST 格式寻找最相似序列打开这个 FAST 文件，开始一个个找最相似序列了。在这个窗口，开始 blast。找到一个序列后复制其 DNA 的编号点击这个按钮出现这个窗口把复制的 DNA 编号手动输入 点击 OK 则这个序列被自动添加到了 FAST 文件里了。一般一个序列寻找 3 个相似度不等的序列。最后，保存为一个新的 FAST 文件。画系统发育树打开前面的 FAST 文件，全选文件”W”一下，再直接点 OK左右两头各删除带* 之前的序列，另存为新的 FAST 文件。打开这个 FAST 文件开始画树。最后对画的树进行一些修饰。
