1、脂肪间充质干细胞治疗外伤性脑损伤中国组织工程研究 第 21 卷 第 1 期 20170108 出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research January 8, 2017 Vol.21, No.1www.CRTER.org朱俊卿，洪 军，崔建忠，王凯杰(河北医科大学附属唐山工人医院，河北省唐山市 063000) 研究原著DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.013 ORCID: 0000-0002-1743-162X(朱俊卿)文章快速阅读：文题释义：脑源性神经营养因子：是 1982 年 Barde 等首先
2、在猪脑中发现的一种具有神经营养作用的蛋白质。脑源性神经营养因子及其受体在神经系统广泛表达。一种小分子二聚体蛋白质脑源性神经营养因子结构、分布及信号转导脑源性神经营养因子分子单体是由 119 个氨基酸残基组成的分泌型成熟多肽，蛋白等电点为 9.99，相对分子质量为 3.5103，主要由 折叠和无规则卷曲二级结构组成，含有 3 个二硫键，为一种碱性蛋白质。脑源性神经营养因子分布在中枢神经系统、周围神经系统、内分泌系统、骨和软骨组织等广泛区域内，但主要是在中枢神经系统内表达，其中海马和皮质的含量最高。胶质细胞源性神经营养因子：于 1993 年由 Lin 等从大鼠神经胶质细胞系 B49 的培养液中首先
3、纯化并命名。目前已在多种神经细胞和神经相关细胞的培养中发现胶质细胞源性神经营养因子表达，并有靶源性神经营养因子的作用。摘要背景：临床与动物研究证实，间充质干细胞移植能迁移至脑损伤区域，对创伤性脑损伤有一定的治疗效果。 目的：进一步验证脂肪间充质干细胞对大鼠外伤性脑损伤造成的局部损伤的治疗作用。方法：大鼠随机分为 3 组：实验组和对照组参照文献以脑冷冻伤法制作 SD 大鼠脑损伤模型，实验组造模成功 2 d 后进行脂肪间充质干细胞尾静脉移植；对照组只尾静脉注射等量生理盐；正常组大鼠不作任何处理。采用 Morris 水迷宫测试评价大鼠神经功能恢复情况；体个分离、培养脂肪间充质干细胞，在倒置显微镜下观
4、察脂肪间充质干细胞的形态，免疫组织化学检测干细胞在大鼠损伤脑组织中的分布及脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子含量。 结果与结论：Morris 水迷宫测试结果显示：与对照组比，实验组 SD 大鼠平均逃避潜伏期迅速下降(P 0.05)，而同时实验组大鼠逃避潜伏期越来越接近于正常组大鼠；免疫组织化学后倒置显微镜观察：移植的经 Brdu 标记的脂肪间充质干细胞大量聚集在损伤的大脑皮质，呈不均匀分布。而对照组大鼠脑组织内未见 BrdU 免疫荧光显色；Western-blot 检测结果显示：实验组经脂肪干细胞静脉移植后，SD 大鼠海马区域中的脑源性神经营养因子和周围损伤皮质中的胶质细胞源性神经营
5、养因子的含量明显高于对照组(P 0.05)。而与正常组 SD 大鼠比较，对照组大鼠脑组织中海马区域中的脑源性神经营养因子含量升高(P 0.05)，而皮质周围的胶质细胞源性神经营养因子含量却明显下降(P 0.05) ；实验结果提示移植的脂肪间充质干细胞向大鼠脑组织的损伤部位分布，并促进了受损脑组织的胶质细胞源性神经营养因子和脑源性神经营养因子分泌，这也可能是对大鼠神经功能恢复的治疗促进作用之一。 关键词：干细胞；移植；脑损伤；间充质干细胞；干细胞移植；大鼠尾静脉；Morris 水迷宫；间充质干细胞；大鼠尾静脉；Morris 水迷宫；脑源性神经营养因子；胶质细胞源性神经营养因子 主题词：间充质干细
6、胞；干细胞移植；脑源性神经营养因子；胶质细胞源性神经营养因子Adipose mesenchymal stem cells for treatment of traumatic brain injuryZhu Jun-qing, Hong Jun, Cui Jian-zhong, Wang Kai-jie (Tangshan Gongren Hospital of Hebei Medical University, Tangshan 063000, Hebei Province, China)ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 朱俊卿，男，1972
7、 年生，汉族，山东省无棣县人，1997 年承德医学院毕业，副主任医师。中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2017)01-00071-06 稿件接受： 2016-11-03Zhu Jun-qing, Associate chief physician, Tangshan Gongren Hospital of Hebei Medical University, Tangshan 063000, Hebei Province, China71Zhu Jun-qing, Associate chief physician, Tangshan Gongren H
8、ospital of Hebei Medical University, Tangshan 063000, Hebei Province, Chinawww.CRTER.orgAbstractBACKGROUND: Clinical and animal studies have confirmed that transplanted mesenchymal stem cells can migrate to the area of brain injury, and exert a certain therapeutic effect on traumatic brain injury.OB
9、JECTIVE: To study the therapeutic effect of adipose mesenchymal stem cells on the local damage induced by traumatic brain injury in rats.METHODS: According to the literatures, the brain injury model of Sprague-Dawley rats was made by brain freezing injury. After successful modeling, the rats were ra
10、ndomly divided into three groups: model rats inexperimental group were administrated with transplantation of adipose mesenchymal stem cells via the tail vein at 2 days after modeling; model rats in control group given the same amount of normal saline; and normal rats in normal group given no treatme
11、nt. Morris water maze test was used to evaluate the recovery of neurological function in rats. The isolated and cultured adipose mesenchymal stem cells were observed under an inverted microscope. The distribution of these cells in the injured brain and the levels of brain-derived neurotrophic factor
12、 (BDNF) and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) were detected by immunohistochemistry method. RESULTS AND CONCLUSION: Morris water maze test results showed that compared with the control group, the average escape latency of rats decreased rapidly in the experimental group, and the dif
13、ference wasstatistically significant (P 0.05), while the escape latency of rats in the experimental group was gradually close to that in the control group. Immunohistochemical findings showed that Brdu-labeled adipose mesenchymal stem cells were accumulated and distributed unevenly in the injured ce
14、rebral cortex. In the control group, there was no BrdU immunofluorescence staining in the rat brain tissues. Western blot test results showed that: compared with the control group, the BDNF and GDNF levels in the hippocampus of rats were significantly higher in theexperimental group (P 0.05), but co
15、mpared with the normal group, the BDNF level in the hippocampus of rats was significantly increased, and the GDNF level in the cortex decreased significantly in the control group (P 0.05). These findings indicate that adipose mesenchymal stem cells can migrate to the damaged area of rats, and promot
16、e the secretion of BDNF and GDNF in the injured brain, which may be one of the mechanisms by which adipose mesenchymal stem cell transplantation improves neurological functional recovery of rats. Subject headings: Mesenchymal Stem Cells; Stem Cell Transplantation; Brain-Derived Neurotrophic Factor;
17、Glial Cell Line-Derived Neurotrophic FactorCite this article: Zhu JQ, Hong J, Cui JZ, Wang KJ. Adipose mesenchymal stem cells for treatment of traumatic brain injury. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(1):71-76.0 引言 Introduction创伤性脑损伤主要是神经元损伤，是神经系统常见不可逆性损伤，往往会给患者带来严重伤害，而且后期生理功能难以恢复，临床上目前对其仍没有有
18、效的治疗方案。近年来研究发现，干细胞具有可增殖及多向分化的能力，且可以自我更新，分化为神经系统中的各类细胞，对受损的神经组织具有一定的修复功能1。干细胞移植给创伤性脑损伤带来了新希望2-4。目前，对于神经系统功能障碍最佳的治疗方案是进行胚胎干细胞移植或神经干细胞移植，进而恢复神经系统的正常生理功能。但由于胚胎干细胞、神经干细胞等受到伦理和来源的限制5，临床上实施应用问题较多，所以临床上应用比较棘手。脂肪间充质干细胞是近年来医学、生命科学等领域研究的热点之一，其作为一种成体间充质干细胞，具有来源丰富，易于体外培养等优点，具多种潜能分化能力，可分化为神经元样细胞、成骨细胞、内皮细胞、脂肪细胞、骨骼
19、肌细胞、成软骨细胞等6-9。国内研究证实，脂肪间充质干细胞在一定的条件下能分化为神经元和神经胶质细胞10-12 。和其他间充质干细胞相比，脂肪间充质干细胞具有取材方便痛苦小、细胞收获量大且广泛、易于体外培养等优点13-15，所以实验采用脂肪充质干细胞作为移植种子细胞。实验通过脑冷冻伤制作 SD 大鼠脑损伤模型，对 SD 大鼠进行脂肪间充质干细胞尾静脉移植，研究脂肪间充质干细胞对大鼠外伤性脑损伤造成的局部损伤的治疗作用。721 材料和方法 Materials and methods1.1 设计 随机分组细胞学动物实验。1.2 时间及地点 于 2014 年 2 至 12 月在河北医科大学附属唐山工
20、人医院实验室完成。 1.3 材料实验动物：七八周龄 SPF 雄性 SD 大鼠 50 只，体质量(21010) g，采购于南方医科大学实验动物中心，合格证书号为 SCXK 粤 2014-0024，购回后于本实验中心在温度(252) 、湿度(50 5)%条件下适应性喂养 1周。其中 5 只 SD 大鼠，用于提取腹腔肠系膜脂肪组织，进行脂肪间充质干细胞的分离及培养。实验的整个过程，以及最后对 SD 大鼠的处置均符合 2006 年中华人民共和国科学技术部颁布的 关于善待实验动物的指导性意见标准16。主要试剂及设备：DMEM(Gibco 美国公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclon 公司 )；荧光素标记
21、抗体(BD 美国公司)；磷酸盐缓冲液(上海麦莎生物科技有限公司)；EPICS-XL 型流式细胞仪(BeckmanCorlter 公司)；IX71型倒置相差显微镜(Olympus 日本公司)。 1.4 实验方法1.4.1 外伤性脑损伤模型建立 模型的建立方法参考文 献制作17-18。造模前，SD 大鼠禁食不禁水 24 h。所有 SD 大鼠称质量后，随机分为正常组，对照组和实验组，每组 10 只。取对照组和实验组雄性大鼠 20只，以 3 mL/kg 腹腔注射体积分数 10%水合氯醛麻醉，将 SD 大鼠头部固定于手P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.o
22、rgCRTER.org术操作台面上，慢慢剪去大鼠头顶部皮毛，用碘消毒后在手术处铺巾，沿中线切开大鼠头皮，剥开骨膜，在人字缝前、矢状缝左侧、冠状缝后用磨钻钻出一直径 5.0 mm 骨窗，打孔过程中要保持硬膜完整。用预冷(-80 ) 处理的铜棒与大鼠硬脑膜接触 1 min，清理创面，缝合骨膜头皮。实验组于模型建造成功 24 h 后经大鼠尾静脉进行脂肪间充质干细胞移植，对照组经尾静脉注射等量的生理盐水，而正常组大鼠不作任何处理。1.4.2 脂肪间充质干细胞的分离、培养和移植 取 SD 大鼠 5 只，腹腔注射体积分数 10%水合氯醛麻醉，无菌条件下从大鼠腹部取脂肪组织，用磷酸盐缓冲液冲洗 3 次，剪刀
23、剪碎，置于离心 EP 管中，加入 0.08%胰酶溶液 5 mL，37 消化 20 min，反复消化 3 次，用 DMEM 培养液终止消化，吸出含有单个核细胞的胰酶溶液，100 目滤网过滤，以 3 000 r/min离心 10 min，磷酸盐缓冲液润洗 2 遍，再离心收集间质血管碎片细胞。加入含体积分数 10%胎牛血清的培养液使细胞悬浮，计数后以密度1104/cm2 移入培养瓶中，于 37 、体积分数 95%湿度及含 5%CO2 的培养箱中孵育。用倒置显微镜密切注意观察细胞的生长状态，约每 2 d 根据实验情况进行换液，弃去未贴壁细胞。细胞融合达到约 90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代培养
24、。实验移植用细胞为第 4 代脂肪间充质干细胞，经流式细胞学鉴定其为脂肪间充质干细胞。实验组 SD 大鼠造模成功 2 d 后进行脂肪间充质干细胞尾静脉移植。脂肪间充质干细胞移植前，第 4 代标有 Brdu 的脂肪间充质干细胞行免疫化学荧光染色，培养 3 d 后，置于荧光显微镜下观察脂肪间充质干细胞 Brdu 的标记情况。收集细胞计数，用生理盐水使干细胞重悬，调整干细胞浓度为 5108 L1，实验组每只 SD 大鼠经尾静脉注射干-缓冲液润湿洗涤 4 次后细胞计数，分装至离心管中，加入培养基制备成脂肪间充质干细胞悬液，样本的细胞数量在 2109 L1 左右，分别加入 CD29-APC 单抗、CD45
25、-PE 单抗、-CD106-PE 单抗，FITC 单抗标记的 CD90 单克隆抗体，避光于 37 培养箱中培养 30 min，用磷酸盐缓冲液洗涤 5 次，加入含体积分数 5%胎牛血清的磷酸盐缓冲液，采用流式细胞仪进行检测细胞表面标志的表达率。1.4.4 SD 大鼠神经功能检测 参照文献方法进行 Morris 水迷宫测试19。实验开展前对大鼠进行一定的引导训练，每天 1 次，训练 2 d，每天上午 8：30 开始检测，水温维持在(251) 。按照随机的原则分别从不同的象限将 SD 大鼠从池壁放入，记录 SD 大鼠从入水到寻找到平台的轨迹线路、以及花费的时间即是逃避伏期。寻找到平台休息并停留约 2
26、5 s 后，进行下一象限的测试，最后结果取平均用时，即为大鼠潜伏期。如果大鼠在 100 s 内未找到平台，将大鼠牵引至平台，并停留 30 s，则大鼠逃避潜伏期记录为 100 s。每天训练 1 次，均在同一时间、地点进行，连续 5 d。 1.4.5 免疫组织化学检测干细胞在大鼠脑损伤中的分布及脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子含量分别于干细胞移植后5，10 ，15，20，30 d 分批从 3 组大鼠中每组随机取 2 只，分别用体积分数为 10%水合氯醛腹腔注射将 SD 大鼠麻醉，固定于解剖台面上，解剖使大鼠心脏充分暴露，用 12 号灌注针快速给大鼠心脏灌注含 10 U/mL 肝素的生理
27、盐水，观察大鼠肝脏为白色为止，开始换成 40 g/L 多聚甲醛固定液灌注，大鼠四肢抽动，表明已经进入大鼠大脑区域，得大鼠完全变硬后快速断头取出大鼠脑组织。固定、包埋、切片，进行免疫组织化学染色，观察 Brdu 标记的脂肪干细胞在大鼠脑组织中的分布情况、病理学变化及脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子含量检测。1.5 主要观察指标 各组大鼠的 Morris 水迷宫检测结果，干细胞形态学观察，免疫细胞化学检测结果。图 2 大鼠外伤性脑损伤建模成功后苏木精-伊红染色结果(400)Figure 2 Hematoxylin-eosin staining results after success
28、ful modeling of traumatic brain injury in rats (400) 图注：大鼠大脑皮质损伤区域可见附近细胞核的碎裂、坏死、凋亡，表明本实验所用模型建模成功。图 3 BrdU 免疫荧光显示静脉移植的干细胞在大鼠脑组织中的分布(200)Figure 3 BrdU immunofluorescence staining showed the distribution of adipose mesenchymal stem cells in the rat brain after intravenous transplantation (200) 图注：图 A 为
29、正常组；B 为实验组；C 为对照组。移植的经 Brdu 标记的脂肪间充质干细胞大量聚集在损伤的大脑皮质，呈不均匀分布；而对照组大鼠脑组织内未见 BrdU 免疫荧光显色。细胞悬液 1 mL，对照组注射等量生理盐水，正常组不作任何处理。1.4.3 脂肪间充质干细胞的鉴定及 Brdu 标记 加入 5 mL 0.08%的胰酶对脂肪间充质干细胞进行消化，再用磷酸盐ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAHABC图 1 脂肪间充质干细胞形态(100) Figure 1 Morphological observation of adipose mesenchymal
30、stem cells (100) 图注：脂肪间充质干细胞呈扁圆形和纺锤形，符合脂肪间充质干细胞的形态。73表1 各组大鼠 Morris 水迷宫测试潜伏期结果 (x_s，n=10，s) Table 1Escape latency of rats in Morris water maze test 检测时间 正常组 对照组 实验组 第1 天44.165.14 95.9127.43 80.0226.33 第2 天 32.138.91 63.2930.85 40.1710.51 第 3 天 20.557.46 48.1826.72 28.6111.32 第 4 天 13.356.31 30.2315.
31、80 19.749.58 第5 天9.415.9222.8411.6714.668.83表注：实验组的潜伏期低于对照组，而略高于正常组的潜伏期， 3组 SD 大鼠的潜伏期随测量时间逐渐缩短。1.6 统计学分析 实验数据采用 SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析，计量资料以 x_s 表示，Morris 水迷宫检测采用单因素的方差分析，组间比较釆用t 检验，以 P 0.05 为差异有显著性意义。2 结果 Results2.1 实验动物数量分析 实验中所用到的 50 只 SD 大鼠全部进入结果分析，无脱失。2.2 体外培养的脂肪间充质干细胞检测结果 在体外培养的 SD 大鼠腹腔肠系脂肪间充质干
32、细胞经流式细胞仪检测，所分离出的细胞培养整合达 90%左右时，脂肪间充质干细胞呈扁圆形和纺锤形，符合脂肪间充质干细胞的形态，具有较好的自我更新能力(图 1)。2.3 SD 大鼠外伤性脑损伤建模结果 实验采用脑冷冻伤制作大鼠外伤性脑损伤模型。各组 SD 大鼠脑冷冻伤建模后没有出现死亡现象，对大鼠的活动没有显著影响，可以正常进行 Morris 水迷宫测试。苏木精-伊红染色检测显示，建模后的大鼠大脑皮质损伤区域出现局限性损伤，各大鼠脑损伤区域基本一致，可见附近细胞核的碎裂、坏死、凋亡，表明本实验所用模型建模成功(图 2)。2.4 各组大鼠 Morris 水迷宫测试结果 各组大鼠测量的第1，2 ，3
33、，4 ，5 天的平均潜伏期，采用单个重复测量因素的方差分析，5次重复测量的数据间存在高度的相关性。脂肪干细胞移植后 Morris 水迷宫测试潜伏期第 1，2 ， 3，4，5 天后，实验组与对照组比，实验组 SD 大鼠平均逃避潜伏期迅速下降，差异有显著性意义(P 0.05)，而同时实验组大鼠逃避潜伏期越来越接近于正常组大鼠，结果见表 1。各组潜伏期指标总体而言不同，可以看出，实验组的潜伏期低于对照组，而略高于正常组的潜伏期，3 组 SD 大鼠的潜伏期随测量时间逐渐缩短。2.5 干细胞在大鼠脑损伤区域中的分布 BrdU 标记的第 4 代脂肪间充质干细胞经 SD 大鼠尾静脉移植后，免疫组织化学后置于
34、倒置显微镜观察在大鼠脑细胞内的分布结果显示，移植的经 Brdu 标记的脂肪间充质干细胞大量聚集在损伤的大脑皮质，呈不均匀分布。而对照组大鼠脑组织内未见 BrdU 免疫荧光显色。说明脂肪间充质干细胞经大鼠尾静脉移植后能通过大鼠血脑屏障迁移至外伤性损伤的大鼠的74www.CRTER.org表 2 大鼠尾静脉移植脂肪间充质干细胞后脑组织脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子的含量 (x_s，n=10，相对表达量 ) Table 2 Effect of adipose mesenchymal stem cells on brain-derived neurotrophic factor and
35、glial cell line-derived neurotrophic factor levels in the rat brain after transplantation组别 脑源性神经营养因子 胶质细胞源性神经营养因子 正常组 0.630.02 0.810.03 对照组 0.780.01 0.670.01 实验组0.960.020.970.02受损区域，进一步在大脑组织中分散(图 3)。2.6 大鼠脑组织中脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子含量检测结果 与对照组比，实验组经脂肪干细胞静脉移植后 SD 大鼠脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子的含量明显高于对照组(P
36、0.05)。而与正常组 SD 大鼠比较，对照组大鼠脑源性神经营养因子含量升高，而皮质周围的胶质细胞源性神经营养因子含量却明显下降(表 2)。单向方差分析显示，各组 SD 大鼠脑组织损伤部位或附近的脑源性神经营养因子与胶质细胞源性神经营养因子的相对表达量有明显的差异性，同时组间比较差异有显著性意义(P 0.05)。3 讨论 Discussion创伤性脑损伤常常会给患者造成对物认知、肢体行为等能力缺陷，严重影响到患者的身体健康，以及给患者家庭带来沉重思想或经济负担，目前临床上对其缺乏有效、安全的治疗技术。虽然大脑拥有有限的再生功能，但促进和扩大脑组织的再生功能技术尚不成熟。大量的临床和动物基础研究
37、显示，胚胎、神经等干细胞移植能够明显促进患者或动物脑损伤后的行为学、认识等功能的恢复改善，移植的干细胞能够通过血脑屏障分布到脑损伤区域，减少损伤区域的细胞损坏，并能促进行为学的改善20-22。实验采用脑冷冻伤制作大鼠外伤性脑损伤模型。各组 SD 大鼠脑冷冻伤建模后没有出现死亡现象，对大鼠的活动没有显著影响，可以正常进行 Morris 水迷宫测试。苏木精-伊红染色检测显示，建模后的大鼠大脑皮质损伤区域出现局限性损伤，各大鼠脑损伤区域基本一致，可见附近细胞核的碎裂、坏死、凋亡，表明本实验所用模型建模成功。间充质干细胞是一种有多向分化能力的干细胞，由于其独特的特点，所以有重要的应用价值。其分布存在范
38、围广，包括脐带、骨髓、脂肪等组织中23-26，从人及其他动物中均可得到。其中研究最多的是骨髓间充质干细胞，在一定的条件下能分化为神经细胞等多种细胞27-30 。与其他间充质干细胞相比，脂肪间充质干细胞具有取材方便痛苦小、细胞收获量大且广泛、易于体外培养等优点。脑源性神经营养因子是一种蛋白质，在脑组织内合成，它广泛分布于中枢神经系统内，对神经细胞的生长发育、P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org本实验研究发现，采用单个重复测量因素的方差分析，5 次重复测量的数据间存在高度的相关性。脂肪干细胞移植后 Morris 水迷宫测试结果显示，实验组与对照
39、组比，实验组 SD 大鼠平均逃避潜伏期迅速下降，差异具有统计学差异(P 0.05)，而同时实验组大鼠逃避潜伏期越来越接近于对照组大鼠。免疫组织化学后置于倒置显微镜观察在大鼠脑细胞内的分布结果显示，移植的经 Brdu 标记的脂肪间充质干细胞大量聚集在损伤的大脑皮质，呈不均匀分布。而对照组大鼠脑组织内未见 BrdU 免疫荧光显色。说明脂肪间充质干细胞经大鼠尾静脉移植后能通过大鼠血脑屏障迁移至外伤性损伤的大鼠的受损区域，进一步在大脑组织中分散。实验提示移植的脂肪间充质干细胞向大鼠脑组织的损伤部位分布，并促进了受损脑组织的胶质细胞源性神经营养因子和脑源性神经营养因子分泌，这也可能是对大鼠神经功能恢复的
40、治疗促进作用之一。作者贡献：设计和评估为第一作者，实施为全体作者。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验动物在戊巴妥纳麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已经过 CNKI 反剽窃文献检测系统进行 3 次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAHwww.CRTER.org作者声明：文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库 )记录及样本已按照有关规定保存、分享
41、和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据知识共享许可协议 “署名-非商业性使用-相同方式共享 3.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References1Abu-Abeeleh M, Bani Ismail ZA, Alzaben KR,et al. Apreliminary st
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