1、慢病毒包装实验的要点：1：良好的 293FT 细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过 30 代；2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多；3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多；实验前要准备的试剂、耗材和仪器；试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM 配好的完全培养基 ,0.25%胰酶，PBS,TRL转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。耗材准备：10cm 细胞培养皿，6 孔细胞培养板，吸头规 格 1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格 15ml、5ml、1.5ml，0
2、.22um PVDF 滤膜和 10ml 无菌注射器，试管架。仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT 细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）；实验前准备：安全柜开紫外灯照 30 分钟；把培养基和试剂放置常温；消化细胞：从 37 5%的 co2 细胞培养箱拿出细胞状态良好的 293FT 细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml 略洗之后吸出，加入 1ml 胰酶消化 1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入 3ml 新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细
3、胞转移至 15ml 离心管内离心 1000r /5min,吸出上清液，加入 10ml PBS 吹打混匀后，离心 1000r /5min, 吸出上清液。细胞铺板：在 10cm 细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5106 个 293FT 细胞吸入 15ml 离心管，再加入完全培养基至 10ml 充分混匀，然后把混匀的 293FT 细胞移入 10cm 培养皿）。放置培养箱中培养 48h。插入铺板后图片刚铺板后铺板 1 天后第三天：上午细胞转染：细胞铺板 48h 后，从培养箱取出 293FT 细胞，倒置显微镜观察，细胞密度达 90%左右；吸出原有培养基，沿皿壁缓慢加入
4、8ml 完全培养基，放置于培养箱中，待 转染。取出 2 个 1.5ml 的离心管，一份加入 142ul 的无血清培养基和 58ulTRL 转染试剂，吹打混匀。另一份加入包装质粒 18ul、目的质粒 10ul 和无血清培养基总体积 200ul 充分混匀。将 2 个离心管液体吹打混匀，室温静置 20 分钟20 分钟后，取出培养箱中的 293FT 细胞，将混合液用 200ul 的小枪头轻轻滴入培养皿中,避免细胞在转染过程中漂起来，然后轻轻十字混匀，放置于培养箱中培养 8h。细胞培养 8h 后，吸出原培养基，沿皿壁缓慢加入 10ml 完全培养基，放入培养箱中继续培养。第四天转染 24h 后取出 293
5、FT 细胞，倒置荧光显微镜观察转染效果第五天转染 48h 后;准备好 1.5ml 离心管，10ml 无菌注射器和 0.22umPVDF 滤膜；收集 48h 后的病毒上清；第六天转染 72h 后，收集 72h 后病毒上清。慢病毒包装完成后如何用慢病毒感染目的细胞步骤一: 感染前一天用 6 孔板铺板，每孔铺 5105 个 293FT 细胞，放置于培养箱中培养 24h。步骤二：准备 3 个离心管分别加入 1ml、500ul、200ul 的病毒液，再依次加入 1ml 的完全培养基和 Polybrene 吹打混匀（ Polybrene 终浓度为 8ug/ml）。步骤三：从培养箱中取出 6 孔板培养的 293FT 细胞，吸出原有培养基，再依次加入 3个离心管中的混合液，混匀后放入培养箱中培养 24h。步骤四：24h 后吸出含病毒的培养基，加入 1ml 完全培养基，培养箱中培养 48h。步骤五：48h 后，带有绿色荧光蛋白标签的病毒，通过 倒置荧光显微镜观察感染效率。步骤六：带 Puromycin 基因筛选标记的病毒，换上终浓度为 1ug/ml 的 Puromycin 的培养基,筛选稳定转导的细胞株(两至三天换一次液)。72h 观察96h 观察
