1、易错 PCR 技术应用于酶体外进化的研究进展沈思军 1*，马春萍 2，哈杰提 2，马全磊 1(1. 石河子大学动物科技学院，新疆，石河子，832003；2. 新疆西部牧业股份有限公司，新疆，石河子，832000)摘 要：易错 PCR 技术是通过调整 PCR 反应条件，产生随机错配而引入多个突变。由于该技术操作简单易行，广泛应用于酶工程改造研究中。本文介绍了易错 PCR 技术的影响因素及近几年在酶工程改造中的应用进展。关键词：易错 PCR 技术；影响因素；酶工程改造在体外进行酶分子改造的常用采用分子体外定向进化技术。常用的方法有易错PCR（error-prone PCR） 、 DNA 重排（DN
2、A shuffling） 、交错延伸法（staggered extension process, StEP） 、随机引物体外重组（ random-priming in vitro recombination, RPR） 、易错滚环扩增法（ error-prone rolling circle amplification, EP-RCA） 、序列饱和诱变（sequence saturation mutagenesis, SeSaM） 、随机插入/ 删除的链交换突变（random insertion/deletion strand exchange mutagenesis, RAISE）等 1。基
3、本原理都是通过导入突变获得大量含有不同突变的酶，在不同环境条件下定向筛选有益突变菌株。易错 PCR是通过改变 PCR 条件，提高扩增产物的三大错配率，从而获得与原来不同的 DNA 序列或基因 2，其操作简便易行，成为体外酶工程应用较为广泛的技术之一。本文就易错PCR 过程中影响突变率的因素和易错 PCR 技术在酶分子进化中的应用这两个方面，综述国内近几年的研究进展。1. 影响易错 PCR 突变率的因素易错 PCR 技术是结合随机突变与定向筛选，利用 Taq DNA 多聚酶不具有 35校对功能的特点，在 PCR 反应中通过调节离子浓度等方法引入随机突变，在特定培养基或培养条件下定向选择所需酶的方
4、法。从而获得天然生物催化剂所不具备的某些优良特性或产生新的催化能力 2。为提高易错 PCR 引入突变的效率，常采用改变Mg2+、Mn 2+离子浓度、调整 4 种的 dNTPs 比例、多轮扩增等方法。1.1 离子浓度在 PCR 反应过程中，离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大。Mg 2+浓度过高可降低PCR 扩增的特异性，稳定非互补配对的碱基对，增加产量；浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。Mn 2+是很多 DNA 聚合酶的诱变因子，加入 Mn2+可以降低聚合酶对模板的特异性，提高错配率。调整 Mg2+和 Mn2+离子浓度，可以获得不同突变频率的多样性文库 3
5、。标准易错 PCR 中 Mg2+浓度为 7mmol/L，而Mn2+浓度根据不同的模板和扩增片段长度的要求，浓度范围在 0.1-0.5mmol/L 之间。刘治江等 4利用易错 PCR 方法进行酶体外进化研究，在优化易错 PCR 条件时设定了不同的 Mg2+和 Mn2+离子浓度，通过扩增片段电泳检测结果确定了最佳扩增效率的 Mg2+和 Mn2+离子浓度分别为 7mmol/L 和 0.5mmol/L。由于 Mn2+浓度受扩增片段的大小和扩增片段碱基组成等因素的影响，所以没有固定推荐的 Mn2+浓度，建立不同 Mn2+浓度梯度的 PCR 反应是优化易错 PCR 体系中最常采用的方法 5-9。1.2 四
6、种 dNTPs 比例易错 PCR 体系中，4 种 dNTPs 比例不是 1:1:1:1 ，改变 4 种 dNTPs 的平衡，主要的目的是提高碱基错配的倾向性，降低扩增过程中聚合酶的保真性，获得更多的突变。易错 P F 的变化带有强烈的倾向性，碱基 A、T 突变为 G 和 C 的变异率高。有研究表明增加 dTTP 和 dCTP 浓度的致突变效果优于增加 dATP 和 dGTP 的效果 10,11，因此在标准的易错 PCR 体系中 4 种 dNTPs 比例 dATPdGTP:dTTPdCTP=1:5。为了简化易错PCR 优化过程，高义平等 12检测了在不添加 Mn2+、不调整其它任何 PCR 成分
7、，只降低 1 种 dNTP 浓度的条件下体外诱变，结果显示随着 dATP 浓度的降低，序列变异率和碱基突变率均成升高趋势，且主要引起 ATGC 的变异。1.3 多轮 PCR易错 PCR 是一种简便快速的在 DNA 序列中随机引入突变的方法，是最常的无性突变技术。该技术的关键是控制诱导片段的突变率 13。为了有效地积累有益突变，常采用二轮 PCR 的方法，以第一轮易错 PCR 产物为模板，不改变 PCR 体系的扩增条件进行第二轮 PCR14-16。2.易错 PCR 在酶体外定向进化中的应用随着分子生物技术的发展，利用基于 PCR 的方法进行酶分子改造已经取得了大量突破性成果。通过定向进化对酶进行
8、改造后显著提高了酶的特性，获得了特定功能的工业酶。利用该方法产生的突变型 -葡聚糖酶的最适 pH 由 7.7 变化至 5.5，且保持了原有的耐热性和比酶活17。SPT3 定向进化的菌株 M25 在 10%的乙醇中生长良好，且提高了利用 125g/L 的葡萄糖进行乙醇发酵时的乙醇产量9。黄瑛等利用易错 PCR 方法得到的突变型脂肪酶其比活力比野生型脂肪酶提高了 1.31 倍18。-甘露聚糖酶是一种半纤维素酶类，可水解半乳甘露聚糖等，可广泛用于造纸、印染等行业，吴秀秀等从易错 PCR 方法建立的 -甘露聚糖酶突变文库中筛选耐酸、耐高温的菌株，并结合DNA 改组技术获得了特定条件下高酶活的菌株19
9、。越来越多的研究利用易错 PCR 进行酶体外进化，这表明该技术是改造酶分子切实有效的方法，在酶的体外高效定向进化研究中有较好的应用前景。参考文献：1 孙志浩,柳志强. 酶的定向进化及其应用J. 生物加工过程,2005,03:7-13.2 高义平,赵和,吕孟雨,杨学举,王海波. 易错 PCR 研究进展及应用J. 核农学报,2013,05:607-6123 汤晓玲，于洪巍. 通过定向进化策略提高酯酶立体选择性的研究 J. 高校化学工程学报. 2011,25(2):283-2884 刘治江，贺淹才，李红然, 等. 采用易错 PCR 对粘质沙雷氏菌几丁质酶 C 进行定向进化. 华侨大学学报(自然科学版
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