1、叶绿素的提取、分离一 、实验目的 1. 掌 握 从 植 物 叶 中 提 取 叶 绿 素 的 方 法 。2. 了 解 纸 层 层 析 的 原 理 ， 掌 握 纸 层 析 的 一 般 操 作 和 定 性 鉴 定 方 法 。二、实验原理1. 叶 绿 素 提 取 原 理 ： 叶 绿 素 等 是 脂 溶 性 的 有 机 分 子 ， 根 据 相 似 相 溶 的 原 理 ， 叶绿体中含有叶绿体色素（叶绿素 a 和 b、胡萝卜素及叶黄素）等 色 素 分 子 溶 于 有 机 溶 剂 而 不 溶于 有 极 性 的 水 。 故 在 研 磨 和 收 集 叶 绿 色 素 时 要 用 丙 酮 或 乙 醇 等 有 机 溶
2、剂 提 取 而 不 用 水 。2. 色 素 分 离 的 原 理 ： 纸 层 析 是 用 滤 纸 作 为 载 体 的 一 种 色 层 分 析 法 ， 其 原 理 主 要 是 利用 混 合 物 中 各 组 分 在 ； 流 动 相 和 固 定 相 的 分 配 比 （ 溶 解 度 ） 的 不 同 而 使 之 分 离 。 滤 纸 上吸 附 的 水 为 固 定 相 （ 滤 纸 纤 维 常 能 吸 20%左 右 的 水 ） ， 有 机 溶 剂 如 乙 醇 等 为 流 动 相 ， 色素 提 取 液 为 层 析 试 样 。 把 试 样 点 在 滤 纸 的 滤 液 细 线 位 置 上 ， 当 流 动 相 溶 剂
3、在 滤 纸 的 毛 细管 的 作 用 下 ， 连 续 不 断 地 沿 着 滤 纸 前 进 通 过 滤 液 细 线 时 ， 试 样 中 各 组 份 便 随 着 流 动 相 溶剂 向 前 移 动 ， 并 在 流 动 相 和 固 定 相 溶 剂 之 间 连 续 一 次 有 一 次 的 分 配 。 结 果 分 配 比 比 较 大的 物 质 移 动 速 度 较 快 ， 移 动 距 离 较 远 ； 分 配 比 较 小 的 物 质 移 动 较 慢 ， 移 动 距 离 较 近 ， 试样 中 各 组 分 分 别 聚 集 在 滤 纸 的 不 同 的 位 置 上 ， 从 而 达 到 分 离 的 目 的 。毛细管点样
4、 薄层色谱展开三 、仪器和药品剪纸形状滤液基线研 钵 、 毛 细 管 、 漏 斗 、 纱 布 、 小 烧 杯 、 试 管 、 培 养 皿 等95%酒 精 、 丙 酮 、 石 油 醚碳 酸 钙 ， 石 英 砂四、实验步骤（ 1） 取 菠 菜 或 其 他 植 物 新 鲜 叶 片 20g 左 右 ， 洗 净 ， 用 滤 纸 擦 干 ， 去 掉 叶 柄 和 中 脉剪 碎 ， 放 入 研 钵 。（ 2） 研 钵 中 加 入 少 量 碳 酸 钙 和 石 英 砂 ， 加 4-5ml 无 水 乙 醇 ， 研 磨 至 糊 状 ， 再 加10ml 无 水 乙 醇 充 分 混 匀 以 提 取 叶 片 匀 浆 中 的
5、 色 素 ， 15-20 分 钟 后 ， 过 滤 入 50ml 锥 形 瓶中 加 塞 待 用 。分 离 ： （ 1） 取 圆 形 定 性 滤 纸 一 张 （ 直 径 15cm） ， 将 其 剪 成 滤 纸 条 （ 15cm2cm） ，将 其 2cm 一 端 剪 去 两 侧 ， 中 间 留 一 长 约 1.5cm， 宽 约 0.5cm 的 窄 条 ， 并 在 滤 纸 剪 口 上 方用 铅 笔 画 一 条 直 线 ， 作 为 画 滤 液 细 线 的 基 准 线 （ 注 意 ： 滤 液 线 必 须 距 底 边 1-1.5cm） 。 用 毛 细 管 吸 取 乙 醇 叶 绿 体 色 素 提 取 液 ，
6、沿 纸 条 的 滤 液 线 涂 ， 等 风 干 后 ， 再 重 复 操 作 数2-3 次 。 （ 用 滤 液 涂 圆 点 状 类 似 ）（ 2） 在 层 析 缸 中 加 入 适 量 （ 约 2ml） 的 丙 酮 作 为 推 动 剂 ， 将 滤 纸 条 带 有 色 素 的 一端 轻 轻 插 入 层 析 缸 中 ， 使 滤 纸 条 下 端 浸 入 推 动 剂 中 。 迅 速 盖 好 层 析 缸 盖 ， 静 置 40-60min。 此 时 ， 推 动 剂 借 毛 细 管 引 力 顺 滤 纸 条 向 上 扩 散 ， 并 把 叶 绿 体 色 素 向 上 推 动 ， 不久 即 可 看 到 各 种 色 素
7、的 条 带 。 （ 3） 当 推 动 剂 前 沿 接 近 滤 纸 边 缘 时 ， 取 出 滤 纸 ， 风 干 ， 即 可 看 到 分 离 的 各 种 色 素 ，从 上 到 下 为 ： 胡 萝 卜 素 为 橙 黄 色 、 叶 黄 素 为 鲜 黄 色 、 叶 绿 素 a 为 蓝 绿 色 ， 叶 绿 素 b 为黄 绿 色 ， 用 铅 笔 标 出 各 种 色 素 的 位 置 和 名 称 。五、数据记录六、注意事项：1. 纸 层 析 法 中 所 用 的 有 机 溶 剂 如 丙 酮 、 石 油 醚 等 ， 一 般 有 挥 发 性 、 并 有 一 定 毒 性 ，使 用 时 要 注 意 密 封 层 析 ， 避
8、 免 吸 入 过 多 有 害 挥 发 物 。2. 叶 绿 素 分 布 于 基 粒 的 片 层 薄 膜 上 ， 加 入 少 许 二 氧 化 硅 是 为 了 磨 碎 细 胞 壁 、 质 膜 、叶 绿 体 被 膜 和 光 合 片 成 ， 使 色 素 溶 解 于 酒 精 中 。 3. 插 入 层 析 液 的 滤 纸 条 一 端 剪 去 两 个 角 ， 由 于 液 面 的 不 同 位 置 表 面 张 力 不 同 ， 纸条 接 近 液 面 时 ， 其 边 缘 的 表 面 的 张 力 较 大 ， 层 析 液 沿 滤 纸 边 缘 扩 散 过 快 ， 而 导 致 色 素 带分 离 不 整 齐 的 现 象 。 4
9、. 加 入 的 层 析 液 要 适 量 ， 滤 纸 放 入 层 析 缸 时 色 素 滤 液 线 不 能 接 入 层 析 液 ， 为 了 防止 滤 纸 条 倒 入 层 析 液 中 而 使 层 析 实 验 失 败 。 同 时 ， 防 止 因 液 体 表 面 张 力 引 起 层 析 液 沿滤 纸 条 向 上 的 “壁 流 ”而 导 致 色 素 溶 解 。 七、思考题：1. 在 研 磨 时 为 什 么 加 入 适 量 的 碳 酸 钙 粉 末 ？ 2. 在 过 滤 时 为 什 么 选 用 脱 脂 棉 或 纱 布 ， 而 不 用 滤 纸 ？3. 画 滤 纸 细 线 前 滤 纸 必 须 经 过 风 干 处 理 ， 为 什 么 不 用 火 烤 干 或 在 烘 箱 内 烘 干 ？
