1、密度梯度离心法分离 PBMC1. 在 15mL 离心管中加入 5mL 淋巴细胞分离液 Ficoll。2. 取 5mL 抗凝静脉血与 5mL 无菌 PBS 按照 1：1 充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上， 动作一定要轻，注意保持清楚的界面。外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为 1：1：1 。3. 水平离心 400g30 分钟。 （注意：为保证分离效果，需将离心机升降速率调至最低，即 升速为 1，降速为 0，这样调整后，升降速会比较慢，总体离心时间约为 1 小时。 ）4. 离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和 PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界
2、面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图 )，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。5. 去除部分上层液体（用移液管吸取，不可倾倒） ，余下约 1mL，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一 15mL 离心管中，加入 5 倍以上体积的 PBS，离心 300g10 分钟，洗涤细胞两次。6. 末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育 2 分钟，裂解红细胞，可根据情况适量增减时间。7. 加入 10mL PBS，离心 300g10 分钟，洗涤细胞两次。血浆和 PBS淋巴细胞分离液红细胞和粒细胞单个核细胞8. 末次离心后，弃上清，加入含有 10%FBS 的 RPMI1640，重悬细胞，计数，计算细胞活力。用本法分离 PBMC，每 1mL 全血可分离得到 12106 PBMC，不同人个体之间存在一定差异。活细胞百分率在 95以上。注意：1. 所有操作都应在无菌条件下进行。2. 在分离前 Ficoll 和 PBS 等试剂均需在 37恒温水浴中 预热半小时以上。3. 吸取单个核细胞时不可避免会吸到 Ficoll，而 Ficoll 密度比细胞要大，因此步骤 5 中需加入足量 PBS 稀释，若 PBS 体积太小可能会导致细胞无法离心收集。
