1、第 16 卷 第 4 期 衡水学院学报 Vol. 16, No. 4 2014 年 8 月 Journal of Hengshui University Aug. 2014 收稿日期： 2014-01-20 作者简介： 高英杰( 1978-),男,河北饶阳人,河北师范大学生命科学学院实验师; 赵红桃( 1983-),女,河北行唐人,河北师范大学生命科学学院讲师,理学博士 . DOI:10.3969/j.issn.1673-2065.2014.04.013 优化的密度梯度离心法提取质粒 DNA 高英杰，赵红桃 (河北师范大学 生命科学学院，河北 石家庄 050024) 摘 要： 质粒常被用做基因
2、的载体纯化质粒 DNA 的方法可以分为 3 种：碱裂解法、煮沸裂解法和 SDS 碱裂解法这些方法可以纯化共价闭合环结构质粒 DNA，而大量获得高纯度的闭环结构质粒 DNA 最经典方法是氯化铯 -溴化乙锭密度梯度离心法该方法经过我们的实践与优化，减少了质粒中蛋白质和基因组 DNA 的污染，提高了质粒的纯度和得率，所得到的质粒用于拟南芥原生质体转化，效率高达 60 % 70 %，明显高于普通的质粒小量抽提试剂盒所提取的质粒 DNA 关键词： 质粒 DNA；氯化铯 -溴化乙锭；密度梯度离心法；拟南芥原生质体；转化效率 中图分类号： Q781 文献标识码： A 文章编号： 1673-2065(2014
3、)04-0049-03 质粒 DNA 是一种基因运载工具，在分子生物学、基因工程中有着极为广泛的应用，作为质粒载体有 3 个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点而质粒 DNA 的分离提取是分子生物学实验中最基本的工作现在已经建立了多种提取纯化质粒 DNA 的方法1，这些方法都包括 3 个步骤：培养细菌，收集和裂解细菌，纯化质粒 DNA由于质粒的大小不同，收集质粒的方法应有所区别，大于 15 kb 的质粒要用温和的方法小于 15 kb 的质粒可以用较剧烈的方法，有些大肠杆菌例如： HB101 不能用加热的方法裂解分离纯化质粒的方法各有利弊，根据不同的实验要求对所提纯质粒的纯度也有
4、所不同，通常提出的质粒都存在一定量的 RNA 和菌体染色体 DNA 的污染2纯化质粒 DNA 最经典的方法是氯化铯 -溴化乙锭密度梯度离心法3，溴化乙锭可以插入 DNA 碱基之间，溴化乙锭与线状 DNA 和闭环 DNA 结合有差别，在饱和溴化乙锭的氯化铯梯度溶液中线状 DNA 的浮密度为 1.54 g/cm3，闭环 DNA 的浮密度为 1.59 g/cm3，所以离心的结果是线状 DNA 和闭环 DNA 会停留在离心管的不同区域，从而将闭环 DNA 分离纯化出来 氯化铯 -溴化乙锭密度梯度离心具体还可以分为连续梯度和不连续梯度区别在于氯化铯溶液浓度在离心管中是否连续，如果是一个连续的浓度梯度，例
5、如加入 10 mg/mL 溴化乙锭的终浓度 1.55 g/mL 的氯化铯溶液，经过超高速离心后会与 DNA、 RNA 等形成一个连续的浓度梯度，闭环 DNA 会悬浮于某一层，从而可以收集纯化不连续梯度是将 3 个不同浓度的氯化铯溶液逐一加至离心瓶中形成 3 种不同浓度氯化铯，这 3 种浓度的氯化铯并不混合，而是形成独立的三层进行离心我们采用连续浓度梯度的方法对质粒 DNA 进行分离，最终优化出了一套纯化方法，用氯化铯溴化乙锭连续密度梯度法可以得到理想的 DNA，用于后续的实验 1 仪器与方法 1.1 仪器 日立超速离心机，型号 CP100WX，转头型号 SRP83VT 1.2 方法 1) 配制
6、试剂：溶液 I(50 mmol/L 葡萄糖， 25 mmol/L pH 8.0 Tris-Cl， 10 mmol/L pH 8.0 EDTA)，溶液 (0.2 mol/L NaOH, 1 g/L SDS)，溶液 (294 g/L 醋酸钾 , 115 mL/L 冰醋酸 )， EB 溶液 (10 mg/mL)， 10 SSC(1.5 mol/L NaCl, 0.15 mol/L 柠檬酸钠 ) 2) 接菌到试管中，摇到混浊后扩培到 1 L 2 YT 培养基中， 37 摇培过夜； 3) 收集菌体，离心条件： 4 000 r/min， 4 ， 20 min，弃上清加入 25 mL 溶液，振荡重悬菌体；
7、4) 加入 50 mL 溶液并缓慢颠倒，冰上放置 2 min； 5) 加入 40 mL 溶液颠倒混匀，冰上放置 5 10 min； ChaoXing50 衡水学院学报投稿平台 :http:/ 第 16 卷 6) 离心： 4 000 r/min， 25 ， 20 min (可用玻璃棒轻轻打碎大块的沉淀，以获得更好的离心效果 )离心后将上清用折叠成漏斗状的 miracloth(Millipore 公司生产 )过滤到新的 250 mL 离心瓶中 (过滤白色不溶物，减少蛋白和基因组 DNA 污染 )，加入等体积的异丙醇，在室温条件下沉淀 15 min，静置后可以见到絮状沉淀； 7) 离心： 12 00
8、0 r/min， 4 ， 10 min，弃去上清，沉淀用 75 %乙醇洗 2 次，每次洗后均需离心 3 5 min，离心后弃去上清； 8) 尽量吸干净上清，晾干沉淀，加入 4 mL 超纯水溶解， (可以用吹风机热风吹 5 s 即可 )，加纯水后，若不易溶，可在 37 条件下促溶，由于质粒浓度大，溶解后比较粘稠有拉丝现象； 9) 将 4 mL 质粒溶液转移到 15 mL 离心管中，加入 5.05 g 氯化铯颠倒混匀，并使其充分溶解 (氯化铯溶解过程中会吸热，溶液会变凉，溶解后会产生絮状物浮在液面，溶液为乳白色 )； 10) 加入 100 L 100 mg/mL 溴化乙锭 (EB)溶液，混匀后离心
9、： 3 000 r/min， 25 ， 10 min， (液面上会有不溶物出现 )； 11) 将上清转移到超速离心管中， (不建议使用移液器转移，因为会有很多气泡出现可以改用注射器吸取并将上清转移 )离心： 65 000 r/min， 25 ， 16 h； 12) 离心结束后，离心管中会出现 3 个明显的红色条带，最上一层为蛋白质，中间一层为缺口环状和线状 DNA，最下一层条带为我们的目的条带闭环质粒 DNA，将质粒约 2 3 mL 吸到 15 mL 离心管中 (吸前先将超速离心管的顶部扎一小孔进气，方便后续吸取质粒层 )然后加入 10 SSC 平衡好的异戊醇，混匀，静置分层后将上层吸出弃去以
10、便抽提溴化乙锭 13) 重复上一步骤直到质粒溶液透明无色，将上层的异丙醇去除干净； 14) 将 250 L 质粒溶液吸到 2 mL 离心管中，加 4 倍体积 70 %乙醇，混匀后室温沉淀 20 min； 15) 离心： 1 200 r/min， 25 ， 10 min，弃上清， 70 %乙醇洗涤沉淀； 16) 离心后将上清吸干，晾干沉淀，每管加入 200 L 超纯水溶解 2 结果与分析 由图 1 和图 2 可以看出，用氯化铯 -溴化乙锭密度梯度离心法提取的质粒 DNA 纯度明显高于普通的质粒小量抽提试剂盒所提取的质粒 DNA，通过超微量紫外可见分光光度计测得质粒 DNA 质量浓度分别为 500
11、 ng/L和 100 ng/L图 1 电泳图所示氯化铯密度梯度离心获得的琼脂糖凝胶电泳亮度明显高于普通的质粒小量提取试剂盒得到的质粒的琼脂糖凝胶电泳对于后续实验，我们对拟南芥原生质体进行双分子荧光互补实验，图 2所示用密度梯度离心法提取的质粒 DNA 可以达到 60 % 70 %的转化率，而普通的质粒小量抽提试剂盒用于拟南芥转化最好只有 10 %的转化效率 A B A：密度梯度离心得到质粒 DNA 电泳图 B：普通质粒抽提试剂盒得到质粒 DNA 电泳图 图 1 质粒电泳检测 图 1A 为用氯化铯密度梯度离心获得的不同构建的质粒的琼脂糖凝胶电泳 图 1B 为用普通的质粒小量提取试剂盒得到的质粒的
12、琼脂糖凝胶电泳 图 1A 一个融合 YFP 的基因，通过氯化铯密度梯度离心获得的高纯度 的质粒，用于拟南芥原生质体的转化，转化效率约为 60 % 70 %，效率较高 图 1B 为用普通的质粒小量提取试剂盒得到的质粒用于拟南芥原生质体转化，转化效率仅为 10 %左右 ChaoXing第 4 期 高英杰，等 优化的密度梯度离心法提取质粒 DNA 51 A：激光共聚焦下观察高纯度的质粒用于拟南芥原生质体的转化 B：普通的质粒用于拟南芥原生质体的转化 图 2 质粒质量鉴定 -原生质体转化 3 讨论 影响氯化铯 -溴化乙锭密度梯度离心法提取质粒 DNA 因素及应注意的事项如下： 1) 实验过程中用到氯化
13、铯及溴化乙锭均为有毒试剂，必须戴手套，减少与皮肤直接接触 2) 离心的次数较多，还需用到超速离心，一定要在专业人员培训后方可操作，以免发生事故 3) 离心结束后，吸取质粒 DNA 时一定要注意，吸前先将超速离心管的顶部扎一小孔进气，方便后续吸取质粒层 4) 对质粒 DNA 要及时进行抽提，过夜或长时间放置都会导致 EB 不容易抽提出来 5) 异丙醇有刺激性气味，进行异丙醇去处操作时最好在通风橱中进行 参考文献： 1 李亮 ,蔡志强 ,赵希岳 .细菌质粒 DNA 的快速提取及检测 J.江苏工业学院学报 ,2003,15(3):30-31. 2 黄南 ,程熠 ,连欢 ,等 .改进溶液 II 配方可
14、提高质粒 DNA 提取的质量及得率 J.华中科技大学学报 :医学版 ,2008,37(6):816-818. 3 J萨姆布鲁克 , D W拉塞尔 .分子克隆实验指南 :上 M.黄培堂 ,译 .北京 :科学出版社 ,2002:53-58. Optimize the Extraction of Plasmid DNA with Method of Density Gradient Centrifugation GAO Ying-jie, ZHAO Hong-tao (College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang, He
15、bei 050024, China) Abstract: Plasmid is often used as gene carrier. Method of purifying plasmid DNA can be divided into three types: the alkaline lysis method, boiling lysis and SDS alkaline lysis method. These methods can be used to purify covalently closed circular plasmid DNA, and the classical m
16、ethod of obtaining high-purity closed circular plasmid DNA is cesium chloride - ethidium bromide density gradient centrifugation. Through practice and optimization, we can reduce the pollution of protein and genomic DNA in plasmid and raise the purity and yield. The obtained plasmid is used for the
17、conversion of arabidopsis thaliana protoplasts, and the conversion efficiency is as high as 60%-70%, which is significantly higher than that extracted with common plasmid extraction test kit. Key words: plasmid DNA; cesium chloride-ethidium bromide; density gradient centrifugation; arabidopsis thaliana protoplast; conversion efficiency (责任编校 ：李建明 英文校对： 李玉玲 ) ChaoXing
