1、氮蓝四唑（NBT ）法测定超氧化物歧化酶 (SOD)的活力一、 目的与要求SOD 在植物抗逆过程中发挥着重要的作用，通过本实验理解其抗逆机理，熟悉其操作步骤及其计算方法。二、原理SOD 是普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 O2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在 560nm 处有最大吸收。而 SOD 可清除 O2-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一个酶活
2、力单位定义为将 NBT 的还原抑制到对照一半（50）时所用的酶量。 22SODH CAT 三、材料、仪器设备及试剂（一）材料：水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为 4000Lx） ；5.试管（三）试剂： 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8: 0.2mol/L Na2HP04 91.5 ml; 0.2mol/L NaH2P04 8.5 ml） ；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称 1.9397gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml；3. 750mol/L 氮蓝四唑溶液：称取 0.06133g
3、NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100mol/L EDTANa 2 溶液：称取 0.03721gEDTANa 2 用磷酸缓冲液定容至 1000ml；5. 20mol/L 核黄素溶液：称取 0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至 1000ml 避光保存。四、实验步骤1. 酶液提取：取叶片 0.5g 于预冷的研钵中，加 2ml 预冷的 PH 7.8 的磷酸缓冲液，在研钵上研磨成匀浆，加缓冲液使终体积为 10ml，取 5ml 于 4 度下4000rpm 离心 15min，上清液即为 SOD 粗提液。2. 显色反应：取 25ml 玻璃管 4 支，2 支为对照管，按下表加入各溶液：试
4、 剂 名 称 用 量（ml）0.05mol/L PH 7.8 磷酸缓冲液 3130mmol/L Met 溶液 0.6750mol/L NBT 溶液 0.6100umol/L EDTA 溶液 0.620mol/L 核黄素 0.6酶液 0.2（对照以失活酶液代替）蒸馏水 1.0总体积 6.6混匀后将 1 支对照管放置暗处，其他各管于 4000Lx 日光下反应 20min（要求各管受光情况一致，反应温度控制在 2535之间，视酶活性高低适当调整反应时间） 。3. SOD 活性测定与计算：至反应结束后，以不光照的对照管做空白，分别测定其他各管的吸光度，按下式计算 SOD 活性。SOD 活性 01().5sTAVFW照光对照管的吸光值 样品管的吸光值0As样液总体积（ml） 测定时样品用量TV 1V（ml）样品鲜重（g）FW
