1、植物科学最前沿公众号粉丝提供，严谨商用，只限自用Pull Down 实验流程1. 混合两种预测相互作用的蛋白。 （Protein-A-GST & Protein-B-HIS，下面实验用 GST 树脂IP，用 Western Blot 检测 HIS；反之亦然。如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液，之后才能继续 Pull Down。 ）2. 加入 1 mL Binding Buffer。Binding Buffer：50 mM Tris.HCl （pH7.50.）100 mM NaCl0.25% Triton-X 10035 mM -Me（巯基乙醇）3. 将混合蛋白在
2、4条件下旋转结合 2-4 h。4. 加入 20-30 L GST-BindTM Resin 结合 2-4 h。5. 4 ，150-200 g 离心 2 min，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀） 。第一次弃去的上清样品记为 Washing- Protein-A/ Protein-B，用于 SDS-PAGE 电泳时的对照。6. 加入 1 mL Binding Buffer， 4 条件下旋转混匀 5-10 min，4 ，150-200 g 离心 2 min，吸弃上清。7. 重复步骤 6，用 1 mL Binding Buffer 清洗 5-6 次。8. 最后一次清洗后留有 20-30 L 液体，加
3、入适量的 Loading Buffer，95金属浴 5-10 min，150-200 g 离心 5 min，样品记为上样跑 SDS-PAGE 电泳。电泳样品顺序：Marker，Protein-A-GST，Protein-B-HIS，Washing- Protein-A/ Protein-B，Pull Down- Protein-A/ Protein-B此次电泳的目的，一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下：（input，蛋白量为后两者的 1/10）Marker，Protein-B-HIS ， GST+ Protein-B
4、-HIS， Protein-A-GST+ Protein-B-HISMarker，Protein-A-GST ， HIS+ Protein-A-GST， Protein-B-HIS+ Protein-B-GST9. 转 PVDF 膜，350 mA 恒流，2 h 左右。 （PVDF 膜用之前，用甲醇泡 2 min）10. 做 Western Blot 过程：预杂交 1 h 以上；杂交一抗 1 h 以上；洗膜三次，每次 10 min ；杂交二抗 1 h 以上；洗膜三次，每次 10 min。11. 显影：用 1 mL 发光液 A + 1 mL 发光液 B 浸润 PVDF 膜，然后固定，显影液显影 1 min（时间可以适当调整） ，水洗，定影 1 min。12. 扫描杂交胶片结果。
