1、 论 文 范 文题目：钾离子通道在不同胎龄大鼠动脉导管收缩的作用医学论文_医药学论文编辑：小小【摘要】 目的 研究大鼠 动脉导管平滑肌中的三磷酸腺苷（ATP）敏感的钾离子通道（KATP）及 电压依赖的钾通道（Kv）的发育变化及其在动脉导管收缩中的作用。方法 通过测量胎龄 19 天（早产）及 21 天（足月）（n=8）胎鼠动 脉导管血管环张力及利用全细胞膜片钳技术方法测量动脉导管单个平滑肌细胞的钾离子电流，观察 KATP 激动剂吡拉地尔和 KATP 阻断剂格列本 脲，Kv 阻断剂 4-氨基吡啶对动脉导管收缩和钾离子电流的影响。结果 格列本脲可收缩胎龄 21 天胎鼠的动脉导管，但对 19 天的无作
2、用。钾电流可以因吡拉地尔增加，因格列本脲减少，但这种减少的电流在胎龄 21 天的动脉导管要明显大于 19 天的。4- 氨基吡啶在两组作用无明显差异。结论 本研究数据提示在早产儿与足月儿比较，总的 Kv 电流无明显差异，但 KATP 电流明显减少，KATP通道未发育成熟，支持 KATP 在动脉导管平滑肌作 为一个氧感受器，是早产儿动脉导管未闭发生率高的原因之一。【关键词】 动脉导管；氧气；钾离子通道；早产儿The role of potassium channels in oxygen-induced contraction of ductus arteriosus in fetal rat o
3、f different gestation age【Abstract】 Objective To investigated the role of ATP sensitive potassium channel and voltage-dependent potassium channel in oxygen-induced contraction of ductus arterioses of rat. Methods Isometric force of contact tissue and potassium current in single smooth muscle cells o
4、f ductus arteriosus were measured in two groups of rats of 19th (premature) and 21st (mature) gestation age respectively. The effects of pinacidil(KATP activater)， glybenclamide (KATP inhibitor)， and 4-aminopyridine(KV inhibitor) were investigated.Results glybenclamide contracted ductus arteries in
5、21st group but not in 19th group. Potassium current increased by applying pinacidil in the perfusion solution and decreased by glybenclamide.The change of the currents， together with the depolarization of the membrane potential were significant greater in 21st group then in 19th group. No significan
6、t different effect of 4-aminopyridine was observed between two groups.Conclusion KATP but not KV channel may be one of the O2 sensors in ductus arterioses. It was underdeveloped in premature fetus. and participate in their poor reaction to oxygen and high incidence of patent ductus arteriosus.【Key w
7、ords】 ductus arteriosus； oxygen； potassium channel； premature fetus新生儿的动脉导管通常在生后数小时到数日关闭。出生后随着呼吸的开始，血氧分压升高是动脉导管收缩的重要原因。早产儿动脉导管对氧浓度变化的反应欠佳，与早产儿动脉导管对氧的敏感性尚未成熟有关。提高灌流液氧分压可引起离体动脉导管收缩。这种氧气引发的动脉导管收缩的机制尚不明确。氧气诱导血管内皮释放内皮素是使动脉导管收缩的原因之一1。Roulet 和 Coburn2发现血氧分压升高可引起细胞膜去极化。研究发现 ATP 依赖的钾通道（ATP-dependent K channe
8、l，KATP，）阻断剂格列本脲，可收缩动 脉导管；而 KATP 开放剂克罗卡林，可以拮抗氧气引发的动脉导管收缩3。因此，笔者推测富氧可以关闭 KATP，从而使平滑肌 细胞膜去极化。但是 Tristani-Firouzi 等4发现在动 脉导管也存在着电压 依赖的钾通道（voltage-dependent K channel，Kv），并在富氧的条件下关闭，因此他们认为动脉导管上的氧感受器是 Kv。KATP 和 Kv 在动脉导管收缩中的作用仍然没有定论。在我们以前的实验中发现，氧气引发的动脉导管收缩现象只在胎龄 21 天的胎鼠动脉导管出现，而在 19 天的不能引出5。在动脉导管中作为氧感受器的通道，
9、在早产儿应该尚未发育成熟。因此，本研究的目的是了解胎鼠动脉导管平滑肌中 KATP 和 Kv 发育情况及它们在动脉导管收缩中的作用，以探明动脉导管的收缩机制。1 对象与方法1.1 对 象 未生育 过的 Wister 鼠，过夜交配后若在阴道拭子发现有精子则初步判断受孕并定为胎龄第 0 天（足月 21.5 天）。胎龄 19 或 21 天时用苯巴比妥(50 mg/kg)腹腔麻醉母鼠后剖腹取胎鼠。整个过程遵循美国生理协会的相应规则。所有试剂及药品均来自美国 Sigma 公司。1.1.1 测量张力使用完整动脉导管环 分离出胎鼠的纵隔组织并置于HEPES 缓冲液中。HEPES 液成分(mM)：NaCl， 1
10、42； KCl， 5； CaCl2， 1.5； glucose，6； MgCl2， 1； HEPES， 5； 用 NaOH 滴定到 pH 7.4，再用 100%氮气(N2)平衡。在解剖显微镜下从胸腔取出 动脉导管，制备成 0.40.6mm 长的血管 环段，然后放于 37的浴槽。1.1.2 电生理实验使用新鲜分离的单个平滑肌细胞 所有用于制备和保存单个动脉导管平滑肌细胞的液体均以 100%N2 平衡。动脉导管和肺动脉从胸腔取出后放置于去钙的 Hanks 溶液。Hanks 液成分(mM)：NaCl 138.8， KCl 5.4， NaH2PO4 1.2， MgCl2 0.5， HEPES 10，
11、EGTA 0.1， 用 1M NaOH 滴定到 pH 7.4。然后把血管剪成小片、置于没有EGTA 的 Hanks消化液，其中含有木瓜蛋白酶 0.4mg/ml， 二硫苏糖醇 0.19mg/ml， 以及牛血清白蛋白 0.2mg/ml；在 37水箱中消化58min，再置于没有 EGTA、含有胶原 酶 0.25mg/ml 的 Hanks液，37消化 57min。再把胶 冻样的组织用毛细吸管移至加有 10 mg/ml葡萄糖的普通 Hanks液并保存在冰中， 实验 开始前轻轻搅动即可获得单个细胞。1.2 方法1.2.1 血管张力测量 按照常用的等容收缩方法测量血管张力。用两根直径 25m 的钨丝穿过血管
12、腔，通过压力传感器(Leonia 公司 Kulite半导体)接到肌动描记器，并记录等容收缩的 张力。实验开始后，用Krebs-Henseleit（K-H）液以 10 ml/min 的速度灌洗。K-H 液成分（mM）：NaCl， 118； KCl， 5； CaCl2， 1.5； glucose，6； MgCl2， 1； NaHCO3， 24； NaH2PO4， 0.436，用 95%N25%CO2 气体平衡，使浴槽中灌洗液 pH 值为 7.387.42；氧分压 2225mmHg；二氧化碳分压3542mmHg。在使用高钾溶液(钾浓度 50 mM)时，用等摩尔的 KCl替代 NaCl。记录血管轴长，
13、两条钨丝之间的距离及牵拉开始时的牵引力。以牵引力(mN) 除以血管 轴长（mm）表示血管壁张力（mN/mm）。对 19 和 21天胎龄的标本，调节其基础张力分别到 0.30.5mN/mm (平均 0.40.1)和0.60.8mN/mm (平均 0.70.1)。采用 3 种方法使动脉导管环收缩：4M 格列本 脲（KATP 通道阻断剂）；10mM 4-氨基吡 啶（4-AP）（Kv 阻断剂）；以及 50mM KCl。格列本脲和4-AP 均溶解在 K-H 液中。1.2.2 膜片钳实验 低氧液以 6ml/min 的速度灌洗，组织池中的氧分压由血气机（Ciba Corning 280）测定，间隔 5min
14、 采样，连续 3 次保持在3035mmHg 时开始实验。细胞放置于操作池中，选择纺锤状、表面光滑、折光性好的平滑肌细胞。电极内液成分(mM) ：KCl 20， KOH 120， MgCl2 2， EGTA 10， HEPES 5， Mg-ATP 1 或 5， aspartate 60 (pH 7.4)。灌流液成分(mM) ：NaCl 143， KCl 5.4， NaH2PO4 0.33， MgCl2 0.5， HEPES 5， NaOH 调节 pH 到 7.4。灌流液用 100%氮气平衡。利用二甲亚砜溶解 KATP 激动剂吡拉地 尔和 KATP 通道阻断剂格列本脲，并使后二者在灌流液中的浓度分
15、别为 110M 和 4M。灌流液中二甲亚砜的浓度不超过 0.2%。电极后尖端阻抗为 56M。调整微推进器，完成 G 封闭后，副压吸引形成全细胞结构。利用 Axopatch 200B 放大器，由 pClamp8.2 发放刺激脉冲，采样频率为 10kHz，低通滤波频率为 2kHz，记录静息膜电位及电流。刺激方案为：保持电位在-70 mV 使钾电流失活，从-80mV 到+60 mV 范围，阶跃 10mV， 刺激频率 0.1 Hz。电流密度表示为电流与细胞膜容积之比，单位 pA/pF。被吡拉地尔激活并被格列本脲抑制的电流即是 KATP 电流。1.3 统计学方法 在 Stateview 及 Clamfi
16、t 分析软件下处理结果。取电流时程的最后 400ms 数据进行测量。结果用平均值标准差表示。未配对的两组均值比较采用 t 检验。对药物反应的统计学比较采用配对 t-检验和分析变量的重复测定。P0.05）；在两组均可观察到 4-AP 引起的血管收缩（P0.05）；只在 21 天组可见由格列本脲引起的动脉导管收缩(P100M)吡拉地尔也会激活 KCa 通道8，故在用吡拉地尔之前常规加入 1 mMTEAC 以减少误差。在 21 天组，由 10 M 吡拉地尔激活的钾电流比 19 天组明显增多。在两组中均发现 10 M 吡拉地尔激活的钾电流最大，浓度继续升高并没有同期增多的电流。被格列本脲阻断的钾电流大
17、小与被 10 M 吡拉地尔激活的钾电流大小相等。这种电流在 21 天组明显大于 19 天组。 当使用 1 M ATP 作为电极液时，4 M 格列本脲可明显抑制钾电流， 提示在这种条件下 KATP 是开放的。而且这种电流在 21 天组明显大于 19 天组（P QsCoO?iGCv2xLN:Zq;_=TuXvWdjC=c24pO6=QDSZ?z6hsju26tO1_AJ_OyVNMCF6Iew1?HPSH|eBSMFAKL2NoUPfrr3Bzhn0OWslHDN0L:|xvuvxof9TmC=zYEmReBvLD_hRl?qpUyh_?q6FofQJEB?A:Ld_t1;ngch3V2=;=il
18、kzbb?GbryEMuPKqjScxix:7WEBfj2ooF2lN4MggvFMrUtTMpKnF_KyuRCLYwrhAqIrTXF?xnk1INf4vJHnolDEj4JW0dZ0GZtP6OOdJLsba3MYob1E07Mql04JYH5p2kVD2dL:Y?F76qg=?jTdThYHVpsC_e|ktlLuoZ7R1WCggGaP;Q7iOKokgQioJU5dQRfXsL4Bm9_HvRZZdiA08s:fn8twThOWMc3929sMY6runAwBKI?_gm_T3G6nOZeHAE?qhtMgUYI5ZSTrcUh:q?:wqC?Ag4IUKu48dWMploy7Qa
19、fBX8Vand_7tAvLrz0rduEzKHYV0ed8Lgpmtt8Z9D;VXFQSPfmOrkl=W52jfDNz=lH88pkxXXz;mvs2_X:_vwPju3|LJu3T=Spn?oQ=ENUwlVAj1xP3nkcHDpH1EabcjnMMI5jx|UczpUJ:oOKc?5LSBz3nIakZtJAgARlr3GP9knJJJbmEEI8AVx|PBYp=KFUayzZzfCs5WUQvh1QCt:fwjBVQhPGLYbLAIQ|CKcZUOe:cLb2pVaFIRh?ZR=5jaViA2|Tfs4q4e4bOoEmQ:xVLjVqZuIkd|q=uAdVOodNWq;399=oG1mbWA:KCb=dJZ?dIriuTHu4GyHKbPLKyAd1rySAmdno8WpDzFljm1=:T|rNuwmAfI4xKRhCmBNDsqJY0oI4A2HCMdSrMD6Hw3suqd4JS0m_QQ9huiH22U|W?R5uOU4mRVxnrHH6arEgPj7w85?hbo7svAa=SGNlZQ5P|hjQp?a3PK_2xfe0QcDXjVby1KBzy48VJb6wNrgdu|_gMTVB|Hg5:;Huxhvyj0_iPcIhZQPQCPQZfxbwfn_X12U6Nb5Qqwm6oTv5at_SQskvbpAd0xymUbMdjH9L8
