1、植 物 生 理 学 研 究 法 （ 设 计 实 验 方 案 、 实 验 报 告 、 课 程 论 文 ）专业年级 姓 名 学 号 任课教师 开课时间 1生命科学学院植物生理与分子生物学实验室 植 物 生 理 学 研 究 法 (课 程 实 习 )盐胁迫下钙对春小麦的生理效应 目 录一、实验设计方案 2二、实验预习报告 4实验一 小麦抗逆性的鉴定（电导仪法） 4实验二 小麦 SOD活性测定（NBT 法） 5实验三 小麦 POD活性测定（愈创木酚法） 7实验四 小麦组织中可溶性蛋白含量的测定（Folin-酚试剂法）8实验五 小麦叶绿素含量测定（分光光度法） 9实验六 小麦脯氨酸含量测定（茚三酮试剂显色
2、法） 112实验七 小麦丙二醛含量测定(TBA 法) 12实验八 小麦水势测定（水势仪法） 13实验九 小麦生物量测定 14三、测定数据记录及计算 15四、课程论文 24一、 植物生理学研究法实验设计方案（10 分）论文题目 盐胁迫下钙对春小麦的生理效应小组成员得分：3选题依据及实验设计选 题 依 据 ：盐胁迫是限制作物生长发育和产量的主要环境因素之一。据统计，我国约有 2.7107hm2不同程度的盐碱地。并且由于人口增长、工业发展、不合理农业灌溉和施肥等原因, 次生盐碱化土壤面积还在继续扩大,直接造成了可用耕地面积的急剧下降, 严重威胁着我国的粮食安全。在人口不断增多、 耕地面积不断减少的现
3、实压力下, 如何利用大面积的盐碱地发展粮食生产, 是迫切需要解决的重大课题。小麦是我国主要的粮食作物之一, 在保障国家粮食安全方面发挥着巨大的作用。而小麦的抗盐能力相对较弱, 特别是在幼苗期、 拔节- 孕穗期容易引起盐害。严重限制了小麦产量的进一步提高。探讨小麦抗盐机理与调控技术对于提高小麦综合生产能力、 保障我国粮食安全和促进生态环境保护均有重要意义。盐碱环境是作物生长和产量提高的重要限制因子，主要影响作物的正常生长发育，并且对作物的光合作用有着严重的抑制作用，高盐碱环境也影响作物水分的吸收和细胞膜的通透性。钙是植物必需的一种矿质营养元素，它对维持细胞壁、细胞膜以及膜结合蛋白的稳定性，调节无
4、机离子运输，以及作为细胞内生理生化反应的第二信使偶联外信号，调控多种酶活性等都具有重要的作用。近年来的研究表明，钙能提高植物织或细胞的多种抗性，如抗冷性抗旱性抗热性抗盐性和抗多种矿质元素毒害胁迫等。本文研究了外源钙对盐胁迫下小麦幼苗各相关生理性状的影响，探讨钙与小麦耐盐性机制之间的关系，以期为耐盐小麦品种的选育以及相关课题的研究提供理论依据和技术支持。实验设计：种子用 0.1 %的 HgCl2消毒 10min，自来水充分冲洗，然后用蒸馏水浸种 24h，播种于盛有石英砂的长方形盘子中，用完全营养液培养。在温室的自然光照下生长，每 4d换 1次完全营养液。 选取生长一致的三叶一心期的幼苗，转移到
5、1 L 塑料烧杯（外裹遮光黑布）中，每杯植苗 4 株。每 4d换一次完全营养液，待主茎第 6叶全展后开始处理分别用：低盐胁迫(150mmol/LNaCl)、低盐胁迫+4mmol/L Ca2+、低盐胁迫+10mmol/L Ca2+、 高盐胁迫(300mmol/LNaCl)、高盐胁迫+4mmol/LCa2+、高盐胁迫+10mmol/LCa2+, 以无 NaCl胁迫的小麦为对照。4d 换一次营养液，待主茎第 6叶全展后开始处理。测量不同条件下处理小麦的抗逆性、SOD 活性、POD 活性、组织中可溶性蛋白含量、叶绿素含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、生物量（鲜重、叶长、根长、干重） 。每个指标的测定进行
6、3 个重复。参考文献：1李彩虹,张维军,王毅等. 盐胁迫条件下钙对春小麦的生理效应J. 宁夏农林科技,2010,(6).2朱晓军,杨劲松,梁永超等. 盐胁迫下钙对水稻幼苗光合作用及相关生理特性的影响J. 中国农业科学,2004,(10).3陈武,陈珈. 盐胁迫对玉米根尖质膜上受钙激活的蛋白激酶的影响J. 植物生理学报,1998,(4).4蔡妙珍，罗安程，林咸永，等.Ca2+ 对过量 Fe2+胁迫下水稻保护酶活性及膜脂过氧化的影响.作物学报，2003，29(3)：447- 451.5李明，王根轩.干旱胁迫对甘草幼苗保护酶活性及脂质过氧化作用的影响J.生态学报，2002，22(4)：503- 50
7、7实验一 小麦抗逆性的鉴定（电导仪法）实验二 小麦 SOD 活性测定（NBT 法）实验三 小麦 POD 活性测定（愈创木酚法）需要测定的生理指实验四 小麦组织中可溶性蛋白含量的测定（Folin- 酚试剂法）4实验五 小麦叶绿素含量测定（分光光度法）实验六 小麦脯氨酸含量测定（茚三酮试剂显色法）实验七 小麦丙二醛含量测定(TBA 法)实验八 小麦水势测定（露点水势仪法）标及方法实验九 小麦生物量（鲜重、叶长、根长、干重）测定指导老师对实验设计方案的意见：指导老师签名： 年 月 日二、生理指标预习报告实验一 小麦抗逆性的鉴定（电导仪法）（一） 原理：逆境（高温或低温）伤害原生质体结构，质膜透性增加
8、，细胞内含物（无机盐）不同程度外渗，使得外液电导度增大（伤害越重，外渗物越多，电导度的增加越大） ，故可用电导仪法测5定外液的电导度增加值而得知膜的伤害程度。（二） 植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）（三） 仪器设备：真空抽滤设备、电导仪、恒温水浴锅、试管架、普通具塞、10ml 移液管、打孔器、镊子、滤纸等。（四） 试剂配制：无离子水（五） 实验步骤及注意事项：1、清洗用具：实验所用的玻璃器皿用洗衣粉洗 自来水冲洗干净 无离子水润洗 倒置在试管架上备用2、材料准备：从各种处理的叶片中选择大小，厚度相对一致发的叶片 分别用自来水冲洗除去表面的污物 再用无离子水清洗 滤纸轻轻吸干表
9、面的水分3、将正常及不同温度处理叶小片分别放入普通试管中 每个处理做两个重复管，每管放入 15 片小叶片中4、叶片抽气，水分交换、测定电导度正常叶片 高盐胁迫 高盐胁迫+钙 低盐胁迫 低盐胁迫+钙空白叶片小块 0 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15无离子水（ml）15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15真空抽气时间抽气 10 分钟水分交换时间水分交换 10 分钟测定初电导值杀死细胞沸水浴 10 分钟测定终电导值相对电导率伤害率注意事项：1、所用的各种处理叶片叶龄要一致2、整个过程中，叶片接触的用具必须绝对洁净，也不要用手接触叶片3、抽气要使叶片下
10、沉才能与水分进行充分交换4、CO2 在水中的溶解度较高，测定电导时要防止 CO2 气源和呼出的 CO2 进入试管，以免影6响结果的准确性（六） 结果计算公式：1、 相对电导度=初电导值空白电导值/终电导值空白电导值逆境叶片的相对电导度正常叶片的相对电导度2、 伤害率（%）=1正常叶片的相对电导度（七） 参考文献：1. 西北农业大学植物生理生化教研室编植物生理学实验指导西安：陕西科学技术出版社。1987实验二 小麦 SOD 活性测定（NBT 法）(一) 原理：SOD 是普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性
11、大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 O2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在 560nm处有最大吸收。而 SOD 可清除 O2-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一个酶活力单位定义为将 NBT 的还原抑制到对照一半（50）时所用的酶量。 (二) 植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）(三) 仪器设备：、高速台式离心机、分光光度计、微量进样器、荧光灯（反应试管处照度为 4000Lx） 、试管(四) 试剂配制：1、提取介质：50mmol/L（pH7.8） 磷酸缓冲液(内含 1
12、%不可溶聚乙烯咯烷酮)2、反应介质：50mmol/L (内含 77.1umol/硝基四唑蓝， ，13.37mmol/L蛋氨酸 3、80.2 umol/L 核黄素溶液：用含有 0.1mmol/LEDTA（pH7.8） 磷酸缓冲液配 44、SOD 反应混合液： 3.9ml 反应介质+0.1ml80.2umol/L 核黄素溶液(五) 实验步骤及注意事项：1、酶液的提取将小麦叶片剪细 混合均匀 称 0.5g 于预冷的研钵中，加入 2ml 预冷的提取介质及少量的石英砂 研磨成匀浆 再加入 4ml 缓冲液，研磨均匀后将均浆液倒入聚乙烯离心管 低温（04 度） ，4000g离心 15min 上清液即为酶液，
13、将上清液倒入离心管 ，用于 SOD 活性测定。2、SOD 活性测定测定管 对照 对照7试剂 正常 高盐胁迫 高盐胁迫 低盐胁迫 低盐胁迫 管 管（参比管酶提取液100ul 100ul 100ul 100ul 100ul 100ul 100ul 100ul 100ul 100ul 提取介质 100ul 100ulSOD反应混合液4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml光照培养箱照光管3000LX 光照下 10min F 放暗处560nm比色OD 值注意事项 ：1.核黄素产生 O2- ，NBT 还原为蓝色的化合物都与光密切相关，因此，测定时要严
14、格控制光照的强度和时间。 2.植物中的酚类对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP） ，尽可能除去植物组织中的酚类等次生代谢物质。 3.测定 SOD 活性时加入的酶量，以能抑制反应的 50为佳。(六) 结果计算公式： VT-总酶液量（ml ）Vs-所用酶液量（50ul）W-叶片鲜重 （g） Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度 AE-样品管吸光度(七) 参考文献：1. 李合生主编.植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社,2000 年 07 月第 1 版.实验三 小麦 POD 活性测定（愈创木酚法）8(一) 原理：过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此
15、化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2 可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的 4-邻甲氧基苯酚红棕色的物质可用分光光度计在470nm 处测定其消光值，即可求出该酶的活性。(二) 植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）(三) 仪器设备：分光光度计、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器(四) 试剂配制：愈创木酚、30%H2O2、0.2mol/L 磷酸缓冲液（PH7.8） 、0.1mol/L 磷酸缓冲溶液（PH6.0， ）反应混合液100mmol/L 磷酸缓冲溶液（ PH6.0）50ml，加入愈创木酚
16、 28l ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解、待溶液冷却后，加入（待溶液冷却后再加入，否则引起分解）30%H2O2 19l ，混合均匀，保存于冰箱中。(五) 实验步骤及注意事项：1、粗酶液的提取：称取小麦叶 0.5g，加磷酸缓冲液（7.8）5ml （分几次加入） ，于研钵中研磨成匀浆，以4000g 离心 15min，收集上清液于冷处（冰箱 4 度保存） 。 2、酶活性的测定：一个试管加反应混合液 3ml，磷酸缓冲液（ 7.8） 1ml ，作为校零对照，另外加入反应混合液 3ml，上述酶液 1ml（龙麦 26 酶液稀释 10 倍，克旱 16 酶液稀释 15 倍） ，立即开启秒表计时，于4
17、70nm 测 OD 值，每隔 15 秒读 1 次值，读 45 秒，以为每 15 秒钟 OD 变化值测酶活性的大小，以OD/min.mg 蛋白质表示。注意事项：(1)、酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。H2O2 要在反应开始前加，不能直接加入。(六) 结果计算公式：过氧化物酶活性u/(g.min)= 式中：A470反应时间内吸光度的变化。 W植物鲜重，g。 VT 提取酶液总体积，mL。Vs 测定时取用酶液体积 ,mL。 t反应时间，min。(七) 参考文献：1. 西北农业大学植物生理生化教研室编植物生理学实验指导西安：陕西科学技术出版社。1987实验四 小麦组织中可溶性蛋白含量的测定（F
18、olin-酚试剂法）(一) 原理：9斐林-酚试剂法 原 理 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应。其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。在 650nm 时比色测定的灵敏度比双缩脲法高 100 倍。由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法适于微量蛋白的测定(范围为 5 l00g 蛋白质)。(二) 植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）(三) 仪器设备：可见分光光度计、分析天平、离心机、恒温水浴锅、
19、微量滴定管、回流冷凝装置、研钵、刻度移液管、大试管、容量瓶、烧杯、量筒、漩涡混合器等。(四) 试剂配制：1)05molL Na0H。2)斐林-酚试剂甲液：由 A、B 两种溶液组成。使用前将 A 与 B 按 50:1 的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。A 液：4碳酸钠(Na2C03)溶液与 0.2mol/L 氢氧化钠(Na0H) 溶液等体积混合。 B 液：1硫酸铜(CuS045H20)溶液与 2酒石酸钾钠溶液等体积混合。 3)斐林-酚试剂乙液4)标准蛋白质溶液：称取 25mg 牛血清蛋白，溶于 100ml 蒸馏水中，使终浓度为 250g/ml(五) 实验步骤及注意事项：（一）标准曲线的绘
20、制 （1） 取 18mm200mm 试管 7 支，1-7 编号，分别加入0mL、0.1mL、 0.2mL、0.4mL 、0.6mL、0.8mL、1.0mL 标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足 1mL，使每管含蛋白量分别为0mol/L、25mol/L、50mol/L、100mol/L、150mol/L 、200mol/L 、250mol/L。 （2） 用定量加样器给每支试管中加入 5mL 甲液，混匀，于 30下放置 10min。 （3） 再向试管中喷射加入 0.5mL 乙液，立即振荡混匀，在 30下准确保温 30min （4） 以不加标准蛋白的 1 号管为空白，在 650nm 下用 1cm 光径的比色
21、皿测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 (二)样品的测定 样品的提取：称取鲜样 05g，用 5mL 蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，4000g 离心 15min，取上清液 10mL（视蛋白质含量适当稀释)于试管中，然后重复标准曲线绘制中的 24 步骤，以空白管调零，测定吸光度。根据吸光度查标准曲线，求出样品中的蛋白质含量。(六) 结果计算公式：样品中蛋白的含量（mg/g）CVT/（Vs FW1000） 式中：C查标准曲线值（ g）VT提取液总体积（ml）FW样品鲜重（g）Vs测定时加样量（ml）(七) 参考文献：1. 文树基主编基础生物化学实验指导西安：陕西科学技术出
22、版社，1994实验五 小麦叶绿素含量测定（分光光度法）10（一） 原理：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度 A 与其中溶质浓度 c和液层厚度 L 成正比，即：A=aCL式中：a 为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 lcm 时，a 为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。今
23、欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度 A，并根据叶绿素 a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素 a、b 时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。已知叶绿素 a、b 的 80丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为 663 nm和 645 nm，又知在波长 663 nm 下，叶绿素 a、b 在该溶液中的吸光系数分别为8204 和 927，在波长 645 nm 下分别为 1675 和 4560，可根据加和性原则列出以下关系式：A 663=8204C a+927C b
24、(1)A645=1675C a+4560C b (2)式(1)、(2)中的 A 663，和 A645，为叶绿素溶液在波长 663 nm 和 645 nm 时的吸光度，C a、C b分别为叶绿素 a 和 b 的浓度，以 mgL 为单位。解方程组(1)、(2) ，得：Ca =1272 A 663一 259 A 645 (3)Cb=2288 A 645一 467 A 663 (4)将 Ca 与 Cb相加即得叶绿素总量 CTCT=Ca+ Cb =2029 A 645+805 A 663 (5)另外，由于叶绿素 a、b 在 652 nm 的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数(均为 345)，也可以在此波长
25、下测定一次吸光度 (A652)而求出叶绿素 a、b 总量：CT = (6)5.341062A在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。Lichtenthaler 等对 Amon 法进行了修正，提出了 80丙酮提取液中三种色素含量的计算公式：Ca=1221 A 663281A 646 (7)Cb=2013 A 646503 A 663 (8)C = (9)291047.3401Cba式中：C a、C b分别为叶绿素 a 和 b 的浓度；C 为类胡萝卜素的总浓度；A 663、A 646和 A470分别为叶绿体色素提取液在波长 663 nm、646 nm 和 470 n
26、m 下的吸光度。由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素 a、b 在 95乙醇中最大吸收峰的波长分别为 665 nm 和 649 nm，类胡萝卜素为470nm，可据此列出以下关系式：C。=1395A 6656 88A649 (10)Cb=2496A 649732A 665 (11)C = (12)2458.10.10CbaA11（二） 植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）（三） 仪器设备：分光光度计，电子顶载天平(感量 00l g)，研钵，棕色容量瓶，小漏斗，定量滤纸，吸水纸，擦镜纸，滴管。（四） 试剂配制(1)95乙
27、醇(或 80丙酮)。(2)石英砂。(3)碳酸钙粉（五） 实验步骤及注意事项：(1)取新鲜植物叶片(或其他绿色组织 )或干材料，擦净组织表面污物，剪碎(去掉中脉) ，混匀。(2)称取剪碎的新鲜样品 02 g，共 3 份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及 23 mL 95乙醇(或 80丙酮)，研成匀浆，再加乙醇 10 mL，继续研磨至组织变白。静置 35 min。(3)取滤纸 l 张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到 25 mL 棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。(4)用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直
28、至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至 25 mL，摇匀。(5)把叶绿体色素提取液倒入光径 l em 的比色杯内。以 95乙醇为空白，在波长 665 nm、649 nm 和 470 nm 下测定吸光度。注意事项： (1)为了避免叶绿索光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。(2)叶绿体色素提取液不能混浊。可在 710 nm 或 750 nm 波长下测量吸光度，其值应小于当波长为叶绿素 a 吸收峰时吸光度值的 5，否则应重新过滤。(3)用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差 1 am，则叶绿素 a 的测定误差为 2，叶绿素b 为
29、19，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素 a 和 b 来校正(表 2121)。(4)在使用低档型号分光光度计( 如：722 型、72l 型等) 测定叶绿素 a、b 含量时，因仪器的狭缝较宽，分光性能差，单色光的纯度低( 57 nm)，与高中档仪器如岛津 UV-120、UV-240 等测定结果相比，叶绿素 a 的测定值偏低，叶绿素 b值偏高，a/b 比值严重偏小。因此，使用时必须用高档分光光度计对低档的分光光度计进行校正。(六) 结果计算公式按公式(10)、(11)、(12)(如用 80丙酮，则按公式 7、8、9) 分别计算叶绿素 a、b 和类胡萝
30、b 素的浓度(mgL) 。(10)、(11)式相加即得叶绿素总浓度。求得色素的浓度后，再按下式计算组织中单位鲜重或干重的各色素的含量：叶绿体色素的含量 (mgg)= 10WNVC式中：C 为色素含量(mg g)；V 为提取液体积（mL） ；W 为样品鲜质量或干质量（g） ；1000 即1L=1000g(七) 参考文献： 1. 邹琦主编植物生理生化实验指导北京：中国农业出版社，19952. 李合生主编.植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社,2000 年 07 月第 1 版.12实验六 小麦脯氨酸含量测定（茚三酮试剂显色法）（一） 原理：在逆境条件下(早、盐碱、热、冷、冻 )，植物体内脯氨酸
31、 (proline，Pro)的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸，因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性。因此亦可作为抗寒育种的生理指标。当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中。色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在 520 nm 波长下比色测定吸光度，从标准曲线上查出
32、 (或用回归方程计算)脯氨酸的含量。（二） 植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）（三） 仪器设备：722 型分光光度计，研钵，小烧杯，容量瓶，大试管，普通试管，移液管，注射器，水浴锅，漏斗，漏斗架，滤纸，剪刀（四） 试剂配制：(1)酸性茚三酮溶液：将 125 g 茚三酮溶于 30 mL 冰醋酸和 20 mL 6 molL磷酸中，搅拌加热(70。C)溶解，贮于冰箱中。(2)。3磺基水杨酸：3 g 磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至 100 mL。(3)冰醋酸。（4）甲苯（五） 实验步棸及注意事项：1标准曲线的绘制(1)在分析天平上精确称取 25 mg 脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水
33、溶解，然后倒人 250 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸 100 ltg。(2)系列脯氨酸浓度的配制。取 6 个 50 mL 容量瓶，分别盛人脯氨酸原液 05 mL、10 mL、15 mL、 20 mL 、25 mL 及 30 mL ，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1ug/mL、2ug/mL、3ug/mL、4ug/mL、5 ug/mL 及 6ug/mL。(3)取 6 支试管，分别吸取 2 mL 系列标准浓度的脯氨酸溶液及 2 mL 冰醋酸和 2 mL 酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热 30 min。(4)冷却后各试管准确加人 4 mL 甲苯，振荡
34、 30 s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于 520 nm 波长处进行比色。(6)标准曲线的绘制：先求出吸光度值(x)依脯氨酸浓度(y)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准喵线，计算 2 mL 测定液中脯氨酸的含量(ug/mL)。2样品的测定(1)脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各 05 g，分别置大管中，然后向各管分别加入5mL 3的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取 10 min(提取过程中要经常摇动)，冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。(2)吸取 2 mL 提取液于另一干净的带玻
35、塞试管中，加入 2 mL 冰醋酸及 2 mL 酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热 30 rain，溶液即呈红色。(3)冷却后加入 4 mL 甲苯，摇荡 30 s，静置片刻，取上层液至 10 mL 离心管中，在 3 000 rmin 下离心 5 rain。(4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上 520 13nm 波长处比色，求得吸光度值。注意事项：(1)测定前所用的烧杯，试管，玻璃仪器必须清洗干净、烘干(2)实验所用的蒸馏水必须是无氨水(3)样品要充分磨成均浆，并用无氨水少量多次将均浆洗入 100 毫升容量瓶，过虑要用干燥滤纸过滤(4)标准曲线应在测定
36、样品的同时多次数以减少操作及反应条件的误差（六） 结果计算公式：根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出 )2 mL 测定液中脯氨酸的含量(ug/mL)，然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：（七） 参考文献:1. 文树基主编基础生物化学实验指导西安：陕西科学技术出版社，19942. 李合生主编.植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社,2000 年 07 月第 1 版.实验七 小麦丙二醛含量测定(TBA 法)（一）原理：植物器官衰老时，或在逆境条件下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(malondialdehyde，MDA)是其产物之一，通常利用它作为脂质过氧化指标，表示细胞膜脂过氧
37、化程度和植物对逆境条件反应的强弱。MDA 在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成在 532 nm 波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物，该复合物的吸光系数为 155mmol(Lcm)，并且在 600 niP波长处有最小光吸收。可按公式A 532一 A600=155 000CL (1)算出 MDA 浓度 C(umolL)，进一步算出单位重量鲜组织中 MDA 含量 C(umolg)。式中 A 532和 A600分别表示 532 nm 和 600 nm 波长处的吸光度值。L 为比色杯厚度(cm) 。需要指出的是，植物组织中糖类物质对 MDATBA 反应有干扰作用。为消除这种干扰，经试验
38、，可用下列公式消除由蔗糖引起的误差。C/umolL=645(A 532一 A600)一 056A 450 (2)式中 A450、A 532、A 600分别代表 450 nm、532 nm 和 600 nm 波长下的吸光度值。用公式(2)可直接求得植物样品提取液中 MDA 的浓度，进一步算出其在植物组织中的含量。（二）植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）（三）仪器设备：研钵，试管，可调加样器，恒温水浴锅，冷冻离心机，分光光度计14（四）试剂配制(1)5三氯乙酸(TCA) 。(2)067硫代巴比妥酸(TBA)。（五）实验步棸及注意事项：(1)取 05 g 植物样品(叶、根 )，加 5
39、TGA 5 mL ，研磨后所得匀浆 3 000g 下离心 10 min。(2)取上清液 2 mL，加 067TBA 2 mL，混合后在 100水浴上煮沸 30 rnin冷却后再离心一次。(3)分别测定上清液在 450 nm、532 nm 和 600 nm 处的吸光度值，并按公式（2）算出 MDA 浓度，再算出单位鲜量组织中的 MDA 含量(umolg)注意事项：(1) 0.10.5的三氯乙酸对 MDATBA 反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高；(2) MDATBA 显色反应的加热时间，最好控制沸水浴 1015min 之间。时间太短或太长均会引起 532nm下的光吸收值下降；(
40、3) 如用 MDA 作为植物衰老指标，首先应检验被测试材料提取液是否能与 TBA 反应形成 532nm 处的吸收峰。否则只测定 532、600nm 两处 A 值，计算结果与实际情况不符，测得的高 A 值是一个假象；(4) 在有糖类物质干扰条件下 (如深度衰老时)，吸光度的增大，不再是由于脂质过氧化产物 MDA 含量的升高，而是水溶性碳水化合物的增加，由此改变了提取液成分，不能再用 532nm、600nm 两处 A 值计算MDA 含量，可测定 510、532、560nm 处的 A 值，用 A532 一(A510A560)/2 的值来代表丙二醛与 TBA反应液的吸光值。（六）结果计算公式C/umo
41、l L=645(A 532一 A600)一 056A 450 式中 A450、A 532、A 600分别代表 450 nm、532 nm 和 600 nm 波长下的吸光度值。（七）参考文献1. 西北农业大学植物生理生化教研室编植物生理学实验指导西安：陕西科学技术出版社。1987实验八 小麦水势测定（水势仪法）（一）原理：将叶片或组织汁液密闭在体积很小的样品室内，经一定时间后，样品室内的空气和植物样品将达到温度和水势的平衡状态。此时，气体的水势（以蒸气压表示）与叶片的水势（或组织汁液的渗透势）相等。因此，只要测出样品室内空气的蒸气压，便可得知植物组织的水势（或汁液的渗透势） 。由于空气的蒸气压与
42、其露点温度具有严格的定量关系，本仪器便通过测定样品室内空气的露点温度而得知其蒸气压。（二）植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）15（三）仪器设备： 露点水势仪（四）实验步棸及注意事项：设定正确参数，将水势仪处于开机状态下 30min 以上，使其达到稳定的工作状态；如参数设定不正确，调整好后再平衡。 （参数调整时，先按“Mode”键将光标移动至要修改的参数处，然后再按“Value”键进行修改，左“Value”键为数值减小，右“Value”键为数值增加） 。平衡时将屏幕切换到Screen#1。 、当水势仪平衡稳定以后，即可以进行水势的测定。测定前将屏幕切换到 Screen#10 输入
43、 ID 号（有效的值为 199，方法按照进行） 。再将“探测头”夹在要测定的植物的叶片上，接着按“Mode”键将屏幕切换到 Screen#8，并将光标移动至“logging”处，按“Value”键使“logging ”处于“On”状态。此时水势仪即正式开始测定数据。 （整个数据的测定过程都由水势仪自动完成） 。每种叶片分别测定三个数据。注意事项1、植物材料应均匀的铺在小盒子上，叶子准备过程操作要迅速，以免失水。 2、压力室法要严格密封，防止漏气。实验九 小麦生物量测定（一）原理：小麦长势是直接反映其生长状况的指标，不同处理的小麦的长势有一定的差别，因此测量小麦的根长、株高、鲜重和干重可观察出不
44、同的处理对小麦的影响。利用干重和鲜重这两个指标可以算出小麦的含水，进一步研究不同浓度盐胁迫和不同浓度钙离子处理对小麦的作用关系。（二）植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）（三）仪器设备：电子天平，烘箱 （四）实验步棸及注意事项：选取 10 棵长势相同的小麦（能够代表改组小麦的生长状况） ，将其清洗干净并吸干水分。叠放整齐，测其株高、根长和鲜重。测量完毕将其置于烘干箱杀青、烘干，然后测其干重。然后根据干重和鲜重这两个指标算出小麦的含水。注意事项1、要将小麦清洗干净，将其根部的胚乳去除（五）结果计算公式小麦含水量（%）=（小麦鲜重小麦干重）小麦鲜重100%16三、测定数据记录及计算实
45、验一 小麦生物量测定（干重、鲜重、根长、叶长）小麦生物量测定 NaCl+Ca(mmol/L) 小麦鲜重(g)小麦干重(g)小麦根长/cm小麦株高/cm含水量（%）0 6.864 3.337 18 26 51.387150 10.35 5.301 15 19 47.629150+4 11.796 6.178 14 23 48.787150+10 11.248 5.611 16 23.5 50.113300 9.898 5.509 14 16 44.343300+4 10.446 5.842 14.5 16 44.071300+10 10.181 5.674 14.5 16.5 44.268实验二
46、 小麦水势测定（露点水势仪法）水势测定样品编号 水势(MPa) 平均值 标准差1 -0.771 -0.96对照组1 -0.92-0.883 0.082 2 -1.122 -0.87150mmol2 -0.8-0.930 0.137 3 -1.873 -1.62150mmol+43 -1.73-1.740 0.102 4 -0.954 -0.94150mmol+104 -1.26-1.05 0.149 5 -3.575 300mmol5 -3.57 0.000 6 -3.446 -3.76300mmol+46 -3.4-3.533 0.161 7 -3.477 -3.44300mmol+107
47、-3.5-3.470 0.024 17实验三 小麦抗逆性的鉴定（电导仪法）小麦抗逆性（电导值）样品编号 初电导值 终电导值 去离子水 相对电导值相对膜透性（%）伤害率/（%）1 14.1 91.41 14 90.3对照组1 4.02 0.115 11.5 2 12 332 12.9 32.7150mmol2 11.5 29.94.02 0.291 29.1 19.8413 16.3 80.13 14.5 78.8150mmol+43 13.7 101.44.02 0.130 13.0 1.7364 20.5 92.54 16.4 103.8150mmol+104 21.4 95.84.02 0
48、.165 16.5 5.6335 18 30.45 19.7 31.9300mmol5 18.1 29.94.02 0.545 54.5 48.626 23.4 36.36 24 31.9300mmol+46 20.7 35.84.02 0.609 60.9 55.827 15.5 36.27 14.1 44.4300mmol+107 28.4 32.64.02 0.454 45.4 38.27518实验四 小麦 SOD 活性测定（NBT 法）SOD活性测定样品编号 吸光度（AE）参比（A CK） ACK-AE(ACK-AE)VACKWVT2SOD总活性 U/g鲜重 平均值 标准差1 0.398 0.496 2.976 133.154 1 0.438 0.456 2.736 12
