1、附录：常用试剂配制及应用一、常用缓冲液、试剂的配制碳酸盐缓冲液(Carbonate-Bicarbonate Buffer)由于碳酸盐 pH值偏碱，因此，常用于 pH9的缓冲液配制（附表 1）。附表 1. 0.2 mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.210.7）pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3 (ml)pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3 (ml)9.2 4.0 46.0 10.0 27.5 22.59.3 7.5 42.5 10.1 30.0 20.09.4 9.5 40.5 10.2 33.0 17.09.5 13.0
2、37.0 10.3 35.5 14.59.6 16.0 34.0 10.4 38.5 11.59.7 19.5 30.5 10.5 40.5 9.59.8 22.0 28.0 10.6 42.5 7.59.9 25.0 25.0 10.7 45.0 5.0磷酸缓冲液(Phosphate Buffers，PB)磷酸盐是使用最广泛的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有二个 pKa 值，所以用它们配制的缓冲液，pH 范围最宽。NaH2PO4：pKa12.12，pKa27.21； Na 2HPO4：pKa17.21，pKa212.32。另外，磷酸盐还有钾盐分子形式，一般来说，低温时钠盐难溶，钾盐易溶，因
3、此，配制细胞培养用试剂时常常添加钾盐试剂，但若配制十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用钠盐而不能用钾盐，因为SDS会与磷酸钾生成难溶的十二烷基硫酸钾。磷酸缓冲液的优点为：可配制成不同离子强度的缓冲液；适用 pH缓冲范围较宽；受温度影响缓冲液 pH值变化较小；离子强度对缓冲液 pH影响较小，如 0.1mol/L缓冲液稀释 10倍其 pH变化小于 0.1。磷酸缓冲液的缺点是：磷酸盐易与钙离子（Ca 2+）、镁离子（Mg 2+）及重金属离子结合生成不溶的沉淀物；可能干扰某些生物化学反应过程，如对某些酶的催化活性具有一定程度的抑制作用。NaH2PO4的 pH值偏酸性，可用作
4、pH10的缓冲液。而 pH68 的中性缓冲液是更常用的缓冲液，需要 NaH2PO4与 Na2HPO4两种磷酸盐混合配制（附表 2）。附表 2. 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.78.2）pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2H PO4 (ml)pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2H PO4 (ml)5.7 93.5 6.5 7.0 39.0 61.05.8 92.0 8.0 7.1 33.0 67.05.9 90.0 10.0 7.2 28.0 72.06.0 87.7 12.3 7.3 23.0 77.06.1 85.0
5、15.0 7.4 19.0 81.06.2 81.5 18.5 7.5 16.0 84.06.3 77.5 22.5 7.6 13.0 87.06.4 73.5 26.5 7.7 10.5 89.56.5 68.5 31.5 7.8 8.5 91.56.6 62.5 37.5 7.9 7.0 93.06.7 56.5 43.5 8.0 5.3 94.76.8 51.0 49.0 8.1 4.2 95.86.9 45.0 55.0 8.2 3.0 97.0磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-buffered saline, PBS)磷酸盐缓冲液是在磷酸缓冲液基础上添加 NaCl以维持溶液的渗透压
6、，因此，PBS适用于做细胞缓冲液，常用 PBS配制如下。NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g在 800ml蒸馏水中溶解，用 HCl调节溶液的 pH值至 7.27.4 加水定容至1L，15psi（1.05kg/cm2）高压灭菌 20min，室温保存备用。Tris缓冲液（Tris-HCl Buffer, TB）Tris的 pH值偏于碱性，因此，通过添加 HCl调节 pH至所需值，Tris-HCl缓冲液的离子强度（mol/L）是专指 Tris的浓度，如某一特定 pH的 0.05 mol/L Tris缓冲液的配制是将 50ml 0.1 mol/L Tris碱
7、溶液与附表 3所示相应体积（ml）的 0.1 mol/L HCl混合，加水至将体积 100ml，即为 0.05 mol/L Tris缓冲液。另外，按附表 3制备的缓冲液，由于试剂来源的不同，缓冲液 pH可能与所需略有差异，此时可通过稍许减少或增加 HCl用量，精细调节 pH至所需值。附表 4. 0.05 mol/L Tris缓冲液pH 需 0.1 mol/L HCl（ml) pH 需 0.1 mol/L HCl（ml)7.1 45.7 8.1 26.27.2 44.7 8.2 22.97.3 43.4 8.3 19.17.4 42.0 8.4 17.27.5 40.3 8.5 14.77.6
8、38.5 8.6 12.47.7 36.6 8.7 10.37.8 34.5 8.8 8.57.9 32.0 8.9 7.08.0 29.2Tris盐缓冲液（TBS）：Tris盐缓冲液是在 Tris缓冲液基础上添加 NaCl以维持溶液的渗透压，因此，TBS 也适用于做细胞缓冲液，常用 TBS配制如下。8g NaCl、0.2g KCl 以及 3g Tris溶解于 800ml蒸馏水中，加入 0.015g酚红并用 HCl调 pH至 7.4用蒸馏水定容至 1L，分装后在 15psi（1.05kg/cm2）高压灭菌 20min，室温保存。现在常用 Tris盐缓冲液通常不加 pH指示剂，而且该溶液如果不用
9、于细胞培养，通常不加 KCl及酚红。Hanks液 (Hanks Balanced Salt Solution)Hanks液是一种平衡盐溶液，主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗等。贮存液 A液：(I)NaCl 80g KCl 4g MgSO47H2O 1gMgCl26H2O 1g用双蒸馏水定容至 450ml。(II)CaCl2 1.4g (或 CaCl22H2O 1.85g)用双蒸馏水定容至 50ml。将 I和 II液混合，即成 A液。贮存液 B液：Na2HPO412H2O 1.52g，KH2PO4 0.6g, 酚红 0.2g, 葡萄糖 10.0g,酚红应先置研钵内磨细，然后按配方顺
10、序一一溶解，用双蒸馏水定容至500ml。 (3)应用液：A、B 储存液分别经 112.6湿热灭菌 20min，取 A和 B液各25ml，加无菌双蒸馏水至 450ml，使用前用无菌的 3.5%或 5.6% NaHCO3调至所需 pH。注意：药品必须全部用 A.R试剂，并按配方顺序加入，用适量双蒸水溶解，待前一种药品完全溶解后再加入后一种药品，最后补足水到总量。无 Ca2+、Mg 2+ Hanks液（ Hanks Solution without calcium, magnesium sulfate）NaCl 80g, KCl 4g, Na2HPO412H2O 1.52g，KH2PO4 0.6g,
11、葡萄糖 10g,用双蒸馏水溶解后，加入 0.4酚红溶液 50ml，再加入双蒸水至1000ml，112.6湿热灭菌 20min，4 冰箱保存。临用前将原液用无菌双蒸水作 1：10 倍稀释，用无菌的 3.5%或 5.6% NaHCO3调至所需 pH。pH7.2柠檬酸盐缓冲液(Citrate Buffer)柠檬酸 0.327g柠檬酸钠 2.63g磷酸氢钠 0.222葡萄糖 0.00255mg蒸馏水加至 100ml。pH3.3枸橼酸-磷酸盐缓冲液（Citric acid- Phosphate Buffer)0.131mol/L citrate acid，0.066mol/L Na2HPO4，等量混合，
12、调节 pH至3.3。0.5 mol/L EDTA, pH 8.0EDTA2H2O 186.1 gNaOH 20 g将 EDTA2H2O加入 800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用 NaOH调节pH至 8.0，EDTA 直到接近 pH 8.0才完全溶解，定容至 1L。分装后高压蒸汽灭菌。0.4%酚红溶液取酚红 0.4g置于研钵中逐滴加入 1mol/L NaOH溶液 11.28ml，边研磨边使酚红转变为钠盐溶于水中，加双蒸水至 100ml，过滤后，4 冰箱保存。醋酸钾（Potassium Acetate）在 60ml 5mol/L醋酸钾溶液中，加入 11.5ml冰醋酸和 28.5ml水。该溶液
13、用于碱性裂解。3mol/L 醋酸钠（Sodium Acetate），pH5.2 和 pH7.0在 800ml水中溶解 408.1g三水醋酸钠，用冰乙酸调 pH至 5.2或用稀释乙酸调 pH至 7.0，加双蒸水至 1L。分装后高压灭菌。柠檬酸钠缓冲液(Sodium Citrate Buffer)柠檬酸钠 1.8gHCl(1mol) 4ml无水乙醇 95ml先用 100ml去离子水溶解柠檬酸钠，然后加入 HCl和无水乙醇，再补充去离子水至总量 200ml。饱合硫酸铵溶液(Saturated Ammonium Sulfate Solution)取 500ml双蒸馏水，加入约 400克硫酸铵，水浴加热
14、至 70，磁力搅拌器充分搅拌，直到加入的硫酸铵不再溶解，以氨水（也可用 NaOH）调 pH7.2，室温保存。二、酶免疫检测常用试剂配制包被液(Coating Buffer)（pH9.5 碳酸盐缓冲液）Na2CO310H2O 8.58g NaHCO3 5.8g 溶于双蒸水至 1000ml。封闭液(Confining liquid)（5%脱脂乳-PBS 溶液，pH7.4）脱脂乳 50g加 0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）至 1000ml溶解。洗液(washing liquid)氯化钠 8.0g磷酸二氢钾 0.2g磷酸氢二钠（12H 2O） 2.9g吐温-20 0.5ml加去离子
15、水至 1000ml溶解即可。终止液(stop buffer)（2mol/L H 2SO4）：21.7ml H2SO4 加去离子水至 200ml。缓冲甘油(glycerine buffer)甘油 9 份PB（pH8.0） 1 份 将 9份甘油与 1份 PB合并，充分混匀。0.5%H2O2-甲醇液(Hydrogen Peroxide-Methanol Solution)（总体积 120ml）3%H2O2 20ml甲醇 100mlDAB-H2O2底物缓冲液(DAB- H 2O2 Substrate Buffer)取 6mg二氨基联苯胺(3,3-Diaminobenzidine Tetrahydroc
16、hloride DAB)溶解于 10ml 0.05mol Tris-HCl pH7.6。使用前取 0.3%H2O2 0.1ml加入到 DAB溶液中(H 2O2的终浓度为 0.003%)。如有沉淀生成，则用滤纸过滤。5-溴-4-氯-3 吲哚磷酸/四唑氮蓝底物显色液（BCIP/NBT Substrate Solution）贮存液配制：NBT：在 10ml 70%的乙醇中溶解 0.5g NBT。BCIP：在 10ml 100%二甲基甲酰胺中溶解 0.5g BCIP。贮存液 4保存，可稳定一年。底物显色液：取 66l NBT贮液与 33l BCIP加入到 10ml碱性磷酸酶缓冲液中，充分混匀，底物显色
17、液应在用前 1小时内配制。三、细胞相关试剂配制L-谷氨酰胺（L-G）溶液（L-glutamin Solution）（0.2 mol/L）称 2.9 g L-谷氨酰胺（分子量为 146.15）用去离子水溶解至 100 ml，过滤除菌，分装小瓶，45 ml/瓶，-20冻存。100x青-链霉素（双抗）溶液（P/S Penicillin/Streptomycin Solution）取青霉素 G（钠盐）100 万单位和链霉素（硫酸盐）1 g，溶于 100 ml去离子水中，分装小瓶，45 ml/瓶，-20冻存。7.5% NaHCO3溶液（NaHCO 3 Solution）称分析纯 NaHCO3 7.5 g
18、，用去离子水溶解至 l00ml，过滤除菌，分装小瓶，45 m1/瓶，盖紧瓶塞，4保存。HEPES溶液（HEPES Solution） （1mol/L）称 23.83 g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基呱嗪-N-2-乙基磺酸，分子量为 238.3） ，用去离子水溶解至100 ml，过滤除菌，分装小瓶，45 m1/瓶，4保存。氨基喋呤（A）贮存液（Aminopterin Stocking Solution）（100, 410-5 mol/L）称 1.76 mg氨基喋呤（ Aminopterin, 分子
19、量 440.4） ，溶于 90 m1去离子水中，滴加 l mol/L NaOH 0.5 m1，并不断搅动，待氨基喋呤完全溶解后，加 1 mol/L的 HCl 0.5m1中和，再补加去离子水至 100 m1。过滤除菌，分装小瓶，2 ml/瓶，-20冻存。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液（HT Stocking Solution）（100,H: 10-2 mol/L; T: 1.610-3 mol/L）称取 136.l mg次黄嘌呤（Hypoxanthine，分子量 136.1）和 38.8 mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine，分子量 242.2） ，加去离子水至 l00 ml，置 4550水浴中使
20、完全溶解，过滤除菌，分装小瓶，2 m1/瓶，-20冻存。用前可置 37加温助溶。HAT培养液培养液 98 ml，A 贮存液 1 m1，HT 贮存液 l ml。秋水仙素溶液（colchicine Solution）称取 10 mg秋水仙素，溶于 100 m1生理盐水中（即为 100 g/ml） ，过滤除菌后，分装小瓶，20冻存备用。Alsevers血细胞保存液（Alsevers Solution）葡萄糖 2.05g, 柠橡酸钠 0.8g, NaCl 0.42g，蒸馏水 l00ml。以上成分混匀后，微加温使其溶解后，用柠檬酸调节 pH 6.1，分装于三角瓶中(3050ml/瓶), 113湿热灭菌
21、15min，4保存备用。细胞冻存液(Freezing Medium)50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。0.025%胰蛋白酶0.2%EDTA 细胞消化液(Trypsin-EDTA Solution)A: 2.5%胰蛋白酶:胰蛋白酶 2.5g磷酸缓冲盐溶液 100ml过滤除菌保存。B: 0.2%二乙胺四乙酸二钠（EDTA）EDTA 0.2g双蒸馏水 100ml高压灭菌保存。取 A液 1份，加 B液 99份，混匀，分装-20保存。0.83% NH4CI溶液(Ammonium Chloride Solution)NH4CI 0.83gKHCO3 0.1gEDTA2Na
22、0.0037g蒸馏水加至 100ml。Tris-NH4Cl溶液(Tris-Ammonium Chloride Solution)NH4Cl 3.735g/450ml双蒸水+Tris 1.3g/50ml 双蒸水（pH 7.65） 。细胞裂解液（Cell Lysis Solution）20mmol/L HEPES(pH 7.5)150mmol/L NaCl1 mmol/L EDTA10g/ml leupeptin1mmol/L PMSF1% Triton X-1000.5% deoxicholate (sodium salt)0.1% SDS组织匀浆缓冲液（Histolysis Buffer）50
23、mmol/L Tris-HCl (pH7.5)150mmol/L NaCl 1% NP401mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride 4g/ml leupeptin1g/ml aprotinin细胞核裂解液(Nuclear Lysis Buffer)10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)150mmol/L NaCl10mmol/L EDTA蛋白酶 K 100g/ml0.4%SDS（最后加）10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）在异丙醇中溶解 PMSF至 1.74mg/ml，即 10mmol/L，分装后保存于-20，如果需要的话，可将储存液制备至 1
24、7.4mg/ml，即 100mmol/L的高浓度。闪烁液(Scintillation Solution)PPO (2,5-二苯基) 5.0g、POPOP（1,4-双5苯基）0.5g 溶于 1000ml二甲苯中。也可将 POPOP加入二甲苯，在 37水浴上溶解后，再加 PPO，然后补足二甲苯。3H-TdR 工作液（woking Solution）按 1:20的比例将浓度为 1mCi/ml的 3HTdR 用无血清的 RPMI培养液稀释，终浓度为 50Ci/ml。肝素溶液的配制： 含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为 50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约
25、为 0.56克/瓶，配制时，可将其溶于 100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为 4 。使用时，向 100ml培养液中加入 1ml（精确可加入 0.9ml）即可。 型胶原酶： 0.1型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20保存。 用时提前一小时 37复温即可 . 0.1%的 I 型胶原酶的配置，100mg的粉末状的 I 型胶原酶可以溶于 100ml 的 DMEM/F12，0.22 微米滤器过滤 0.1%的 I 型胶原酶的配置，100mg 的粉末状的 I 型胶原酶可以溶
26、于 100ml 的 DMEM/F12，0.22 微米滤器过滤.四、染色液配制（Prepration of Staining Solution）苏木素液(Hematoxylin Solution)：苏木素 2.5g，乙醇 25.0ml，钾明矾 2.5g，氧化汞 1.25g，冰乙酸 20.0ml，蒸馏水 500.0ml。配制方法是先将苏木素溶于乙醇中（稍加热） 。将预先已溶解明矾的蒸馏水加入苏木素乙醇液中，使溶液尽快沸腾后，将火焰熄灭，慢慢加入氧化汞，防止溶液油溅出，再煮沸 2min。将烧瓶立即浸入冷水中，当染液冷却后，加入醋酸，室温保存，用前过滤。伊红 Y染色液(Eosin Y Solution
27、)伊红 Y 0.51.0g，蒸馏水 75ml，95%乙醇 25ml，冰乙酸 12 滴。先取少许蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红研碎，再加入全部蒸馏水，溶解后加入乙醇。甲基绿染色液(Methyl Greeen Solution)新购买的甲基绿需用氯仿处理去除甲基紫。方法是将 2%甲基绿水溶液 20ml倾入洁净分液漏斗，移去慢慢下沉带紫红色的氯仿，再加入新的氯仿 10ml，如此反复更换氯仿，到无紫红色为止。该液作为贮存液，4保存。染色液：甲基绿贮存液 5ml，5%派诺宁水溶液 1ml，蒸馏水 12ml，0.2mol/L 乙酸钠(pH4.8)18ml（临用前配制，滤纸过滤） 。吖啶橙贮存液(Acridi
28、ne Orange Stocking Solution) 10mg吖啶橙溶解于 100ml PBS中，pH4.86.0 滤过，4避光保存。吉姆萨贮存液(Giemsa Solution)吉姆萨染色粉 1g先溶于少量甘油，在研钵内研磨 30min以上，至看不见颗粒为止，再将全部(66ml)剩余甘油倒入，于 56温箱内保温 2h。然后再加入甲醇(66ml)，搅匀后保存于棕色瓶中。母液配制后放入冰箱可长期保存，一般刚配制的母液染色效果欠佳，保存时间越长越好。临用时用 pH7.4磷酸缓冲液稀释 10倍，随配随用。瑞氏染色液(Wrights Solution)瑞氏染色粉 0.3g甘油 3ml甲醇 97ml
29、将瑞氏染色粉放干燥研钵内磨细，加入甘油继续研磨，不断滴加甲醇并继续研磨，将上层溶解的染料倒入棕色瓶中，直至染料全溶后加甲醇至所需量。混匀后置棕色瓶中保存，用前过滤。一般配制后置室温一周便可使用，保存时间愈入，则染色效果愈佳。吉姆萨-瑞氏染色液(Giemsa- Wrights Staining Solution)瑞氏染色粉 0.3g吉姆萨染色粉 0.03g甲醇 100ml将二种粉末置于研钵中磨细，再逐滴加入甲醇混匀后倒入棕色瓶中，塞紧瓶口并充分振荡。置室温溶解后使用。噻唑兰（MTT）称取 250mgMTT，加 50ml PBS（0.01mol/L，pH 7.4）在磁力搅拌器上搅拌30min，用
30、0.22m 的微孔滤膜过滤除菌，分装，4保存。两周内有效。台酚蓝染色液(Trypan Blue Solution)A：台酚蓝染料 1g蒸馏水 100ml将染料置于研钵中边研磨边加入蒸馏水溶解。B：NaCl 1.7g蒸馏水 100ml临用前 A、B 液 1：1 混合，离心沉淀，取上清供染色用。混合后的染液存放过久，易形成沉淀，故应新鲜配制。染色时，取细胞悬液 0.1ml加入新鲜配制的染色液一滴，室温下染 510分钟，取一滴悬液于载波片上，加盖玻片，高倍镜下检查。死亡细胞膨大并染成浅蓝色，活细胞不着色，大小正常。五、固定剂(Fixatives)大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研
31、究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。4%多聚甲醛-0.1mol/L 磷酸缓冲液, pH7.3（formaldehyde-Phasphate Buffer）多聚甲醛 40g0.1mol/L 磷酸缓冲液 至 1000ml配制方法：称取 40g多聚甲醛，置
32、于三角烧瓶中，加入 500800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer 以下简称 PB），加热至 60左右，持续搅拌（或磁力搅拌）至完全溶解，通常需滴加少许 1N NaOH才能使溶液清亮，最后补足 0.1mol/L的 PB于 1000ml，充分混匀。该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定 224h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠（formaldehyde-Sodium Phosphate/Sodium Hydroxide Buffer）A 液：多聚甲醛 40g蒸馏水 400m
33、lB 液：Na 2HPO42H2O 16.88g蒸馏水 300mlC 液：NaOH 3.86g蒸馏水 200ml配制方法：A 液最好在 500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B 液和 C液配制好后，将 B液倒入 C液中，混合后再加入 A液，以 1N NaOH或 1N HCl 将 pH调至 7.27.4，最后，补充双蒸水至 1000ml充分混合，4冰箱保存备用。该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为 0.5%1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组
34、织标本于该固定液中，4冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。六、蛋白电泳相关试剂30丙烯酰胺（Acrylmide）丙烯酰胺 29gN, N-亚甲双丙烯酰胺 1g溶于 60ml水中，加热至 37溶解，补加水至终体积 100ml。0.45M 滤器过滤除杂质，置深色瓶中室温保存。考马斯亮蓝 R-250染色液（Coomassie Staining Solution）1. 称取 1 g考马斯亮蓝 R-250，置于 1 L烧杯中。2. 量取 250 ml的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。3. 加入 100 ml的冰醋酸，搅拌均匀。4. 加入 650 ml的去离子水，搅拌均匀。5. 用滤纸除去颗粒物质后，室温
35、保存。考马斯亮蓝脱色液（Destaining Solution）量取下列溶液，置于 1 L烧杯中，充分混合后使用。醋酸 100ml乙醇 50mldH2O 850ml 1mol/L二硫苏糖醇贮存液（DTT Stocking Solution）用 20ml 0.01mol/L 乙酸钠溶液（pH5.2）溶解 3.09gDTT，过滤除菌后分装成 1ml小份贮存于20保存。DTT 或含有 DTT的溶液不能进行高压处理。0.1mol/L pH 2.4甘氨酸-HCl 缓冲液(Glycine-HCl Buffer)称取固体甘氨酸 (MW 75.07)15.01克，用蒸馏水溶解后，加入 0.2mol/L HCl
36、 648ml，然后定容成 2000ml。2SDS凝胶加样缓冲液(2Loading Buffer)100 mmol/L Tris.Cl（pH6.8）200 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）4%SDS（电泳级）0.2% 溴酚蓝20% 甘油不含二硫苏糖醇的 2SDS凝胶加样缓冲液可以保存于室温，临用前须从1mol/L二硫苏糖醇（DTT）贮存液现用现加于上述缓冲液。10%十二烷基硫酸钠（SDS）在 900ml蒸馏水中溶解 100g电泳级 SDS,加热至 68助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的 pH值至 7.2，加水定容至 1L，分装备用。SDS的微细晶粒易于扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在
37、称量工作区和天平上的 SDS,10%SDS溶液无需灭菌。电转印缓冲液为(Semi-Dry Transfer Buffer)Tris 3gGlycine 14.4gSDS 0.185g加入甲醇 200ml，用去离子水调至 1000ml。Tris-乙酸 50（TAE）Tris 碱 242g冰乙酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 100ml蒸馏水定容至 1L。Tris-硼酸 5（TBE）Tris 碱 54g硼酸 27.5g0.5mol/L EDTA(pH8.0) 20ml蒸馏水定容至 1L。TE缓冲液 10(pH7.4, 7.6, 8.0) 1. 量取下列溶液，置于 1 L烧
38、杯中。1mol/L Tris-HCl(pH7.4, 7.6, 8.0) 100ml500mmol/L EDTA(pH8.0) 20ml2. 向烧杯中加入约 800 ml的去离子水，均匀混合。3. 将溶液定容至 1 L后，高温高压灭菌。4. 室温保存。Tris甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine Buffer 5）Tris 15.1g甘氨酸（电泳级） 94g10SDS（电泳级） 50ml蒸馏水定容至 1L。七、淋巴细胞分离液聚蔗糖泛影葡胺分层液(Ficoll-paque Gradient Mixer)90g/L聚蔗糖 15ml，加 500g/L泛影葡胺 10ml（比重 1.14)。90g/L聚
39、蔗糖 17.5ml，加 500g/L泛影葡胺 10ml（比重 1.13)。90g/L聚蔗糖 20ml，加 500g/L泛影葡胺 10ml（比重 1.12)。90g/L聚蔗糖 24ml，加 500g/L泛影葡胺 10ml(比重 1.08)。Percoll配制 (Prepration of Percoll)将一份 10PBS与 9份 Percoll贮存液混合，制成等渗 Percoll悬液，此悬液被认为是 100%Percoll，其密度为 1.1294/ml。利用 1PBS或细胞培养液稀释 100% Percoll，可获得适宜密度的细胞分层液，用于各种细胞的分离，其浓度与密度的关系如下：70% Pe
40、rcoll 比重 1.090g/ml60% Percoll 比重 1.077g/ml50% Percoll 比重 1.067g/ml40% Percoll 比重 1.056g/ml30% Percoll 比重 1.043g/ml20% Percoll 比重 1.037g/ml人外周血单个核细胞（PBMC）分离 Ficoll 分层液配制9聚蔗糖（Ficoll） 24 份34泛影葡胺（Urografin） 10混合，测比重为 1.0771.078，G5 玻璃滤器过滤除菌。4冰箱保存备用。八、其它试剂佐剂(Adjuvant)动物实验常用弗氏佐剂（Freund adjuvant） ，其成分通常是羊毛脂
41、 1份、液体石腊油 5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为 1：29（V/V） ，充分混合后即是不完全福氏佐剂，如果在每毫升不完全佐剂加入 120mg 卡介苗就成为完全弗氏佐剂。配制方法：将羊毛脂与石蜡油按比例置于容器内，超声波混匀，高压灭菌，4保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗 34mg/ml 或不加） ，加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上 510min 内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二
42、者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。清洁液(Cleaning Solution)配方 1： 重铬酸钾 100g 蒸馏水 200ml 浓硫酸 800ml 将重铬酸钾加入蒸馏水中，使之自然溶解或水浴溶解，亦可在大坩埚中加热溶解，然后慢慢加入浓硫酸，边加边搅拌，见发热过剧则稍停，冷却后再继续加。此为强洗液。盛清洁液的容器要坚固，上加厚玻璃盖，操作时要穿橡皮围裙、长统胶靴、戴上眼镜和厚胶皮手套，以保安全。洗液一旦变绿，表示铬酸已经还原，失去了氧化能力，不宜再用。如将这样洗液加热，再加适量重铬酸钾，又可重新使用。 配方 2： 重铬酸钾 60g蒸馏水 300ml浓
43、硫酸 460ml此为中等强度洗液。 配方 3： 重铬酸钾 100g蒸馏水 750ml浓硫酸 250ml此液为弱洗液，为棕红色。使用此液时，必须预先用热肥皂水将玻璃器皿洗净，经自来水冲洗，沥干然后才能浸入，否则该洗液很快失效。（崔雪玲）氨苄青霉素（Ampicillin ）在 9ml 蒸馏水中溶解 1g Ampicillin 粉末并定容至 10ml，然后用 0.22 um 微孔滤膜过滤除菌，分装成小份存于-20。青、链霉素溶液：所用纯净水（双蒸水）需要 15磅高压 20分钟灭菌。具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80万单位/瓶，用注射器加 4ml灭菌双蒸水。链霉素是 100万单位/瓶，加 5ml
44、灭菌双蒸水，即每毫升各为 20万单位。分装于20保存。使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为 100单位/ml。3%酸性酒精溶液浓盐酸 3ml 95%酒精 97ml中性红指示剂中性红 004g 95%乙醇 28ml 蒸馏水 72ml 中性红 pH6.88，颜色由红变黄，常用浓度为 004%淀粉水解试验用碘液(卢戈氏碘液)碘片 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300ml 先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。溴甲酚紫指示剂溴甲酚紫 004g 001mol/L NaOH 74ml 蒸馏水 926ml 溴甲酚紫 pH5268，颜色由黄变紫，常用浓度为 004
45、%。溴麝香草酚蓝指示剂溴麝香草酚蓝 004g 001mol/L NaOH 64ml 蒸馏水 936ml 溴麝香草酚蓝 pH6076，颜色由黄变蓝，常用浓度为 004%。甲基红试剂甲基红(Methyl red) 004g 95%酒精 60ml 蒸馏水 40ml 先将甲基红溶于 95%酒精中，然后加入蒸馏水即可。VP试剂15%-萘酚无水酒精溶液-萘酚 5g 无水乙醇 100ml 240%KOH 溶液KOH 40g 蒸馏水 100ml吲哚试剂对二甲基氨基苯甲醛 2g 95%乙醇 190ml 浓盐酸 40ml格里斯氏(Griess)试剂A液：对氨基苯磺酸 05g 10%稀醋酸 150ml B液：-萘胺
46、 01g 蒸馏水 20ml 10%稀醋酸 150ml二苯胺试剂二苯胺 05g 溶于 100ml浓硫酸中，用 20ml蒸馏水稀释十一、阿氏(Alsever)血液保存液柠檬酸三钠2H2O 8g 柠檬酸 05g 无水葡萄糖 187g NaCl 42g 蒸馏水 1000ml 将各成分溶解于蒸馏水后，用滤纸过滤，分装，056070kg/cm 2(810磅/英寸 2)，灭菌 20分钟。冰箱保存备用。pH86 离子强度 0075mol/L 巴比妥缓冲液巴比妥 276g 巴比妥钠 1545g 蒸馏水 1000ml1%离子琼脂琼脂粉 1g 巴比妥缓冲液 50ml 蒸馏水 50ml 1%硫柳汞 1 滴称取琼脂粉
47、1g先加至 50ml蒸馏水中，于沸水浴中加热溶解，然后加入50ml巴比妥缓冲液，再滴加 1滴 1%硫柳汞溶液防腐，分装试管内，放冰箱中备用。电泳缓冲液50Tris-乙酸（TAE）缓冲液成分及终浓度配制 1L溶液各成分的用量2mol/L Tris碱1mol/L 乙酸100 mmol/L EDTA 水 242g 57.1 ml的冰乙酸（17.4 mol/L）200ml的 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）补足 1L 1溴酚蓝加 1g水溶性钠型溴酚蓝于 100ml水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。1二甲苯青 FF（xylene cyanole FF）溶解 1g二甲苯青 FF于足量水中，定容到 100ml。10mg/ml的溴化乙锭小心称取 1g溴化乙锭，转移到广口瓶中，加 100ml水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于 4贮存。四常用抗生素氨苄青霉素（ampicillin） （100mg/ml）溶解 1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至 10ml。分装成小份于-20贮存。常以 25ug/ml50ug/ml 的终浓度添加于生长培养基。羧苄青霉素（carbenicillin
