1、血清 -球蛋白的分离纯化与鉴定及电泳分析【实验目的】1、了解蛋白质分离提纯的总体思路。2、掌握盐析法、凝胶层析法和离子交换层析的实验原理及操作技术3、掌握电泳法分离纯化蛋白质的方法。【实验原理】1、蛋白质的粗提盐析法胶体的盐析是加盐，盐中的带电粒子使蛋白质周围的水化膜减弱，胶粒溶解度降低，形成沉淀析出的过程，是胶体的聚沉现象的一种。向蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐如(NH4)2SO4 或 Na2SO4溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做盐析。盐析不能使蛋白质变性，可以复原。利用这个性质，可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质。蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子
2、周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，蛋白质溶解度更加降低，之蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。由于清蛋白的亲水性比球蛋白大，且清蛋白的
3、分子比球蛋白小，所以清蛋白需要高浓度的盐溶液才能够发生盐析，低浓度的时候球蛋白发生盐析。盐析法分离蛋白质：各种蛋白质的颗粒大小、亲水程度、pI 不同，盐析所需的盐浓度也不一样。调节盐浓度可使不同的蛋白质沉淀，从而达到分离的目的。常用中性盐：硫酸铵、硫酸钠等。硫酸铵：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，盐析效果好，不易引起变性。可用硫酸/氨水按需要调节 pH 值。本实验中清蛋白分子小，亲水性强，在饱和硫酸铵溶液中可沉淀析出，而球蛋白分子大，亲水性弱，在半饱和硫酸铵溶液中即可沉淀析出。因此调节盐浓度可使球蛋白与清蛋白分离。2、脱盐凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝
4、胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠本身象个“筛子“。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有
5、很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。盐析后的蛋白质溶液进行凝胶层析则分子量大的球蛋白先流出，由此可获得脱盐的球蛋白溶液。3、纯化离子交换法离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同，借以分离混合物中各种离子的一种层析技术。离子交换层析的固定相是载有大量电荷的离子交换剂，流动相是具有一定 pH 和一定离子强度的电解质溶液，当混合物溶液中带有与离子交换剂相反电荷的溶质流经离子交换剂时，后者即对不同溶质进行选择性吸附。离子交换剂根据其所带电荷的性质分为阴离子交换剂和阳离子交换剂两类。
6、阴离子交换剂本身带有正电荷，可以吸引并结合混合物中带负电荷的物质；阳离子交换剂本身带负电荷，可以吸引并结合混合物中带正电荷的物质。本次试验采用 DEAE-纤维素阴离子交换剂，1-球蛋白、 2-球蛋白、 -球蛋白和 -球蛋白 pI 都不同， 1-球蛋白、 2-球蛋白、 -球蛋白 pI 都小于 6，-球蛋白为 7.3，所以在 pH=6.5 的洗脱液环境下，-球蛋白带正电，其他球蛋白带负电，因而使 -球蛋白与其他种类球蛋白分离。凝胶层析脱盐固定相：Sephadex G-25流动相：pH6.5 0.02M 醋酸盐缓冲液。离子交换层析纯化 -球蛋白固定相：DEAE 纤维素（阴离子交换剂）流动相：pH6.
7、5 0.02M 醋酸盐缓冲液。浓缩：高分子性质：Sephadex G-25 吸水4、电泳分析蛋白质血清中各种蛋白质都有其特有的等电点，利用 pI 与 pH 的关系，pHpI，待分离物质带负电，电泳时向正极移动；pH，待分离物质带正电，电泳时向负极移动；pH=pI，待分离物质不带电，电泳时不向正极或者负极移动。在同一条件下，不同蛋白质带电荷有差异，分子量大小也不同，所以泳动速度不同。血清中蛋白质等电点均低于 7，在 pH=8.6 的缓冲溶液中，都形成负离子向正极移动，血清蛋白质可分成五条区带。【实验结果】经过电泳分析，与对照组做对比可以明显观察到血清蛋白（清蛋白、 1-球蛋白、 2-球蛋白、 -
8、球蛋白和 -球蛋白）的五条带左侧为全血清对照，右侧为我们组提取的蛋白质电泳结果。【实验分析】优点1 提取的 蛋白较为成功，纯度较高，基本没有肉眼可见到的其他带的蛋白（与左侧的对照组相比较可知）。2.在进行层析操作时，严格进行转圈滴加，使得液面保持一个水平状态，保证液体留下时经过相同的距离。3.硫酸铵在进行滴加时，严格按照边摇边逐滴加入。4.层析柱的上液层未干涸，保证时刻有液体。5. 离子交换柱使用完后先用醋酸盐缓冲液洗两个柱长，再用 DEAE 再生液洗两个柱长，最后再用醋酸盐缓冲液平衡两个柱长。方便后边的同学使用。6. 凝胶柱使用完毕后用洗脱液流洗 34 个柱长，保持上层有 2cm 以上的液体
9、，关闭下方控制夹。方便后边的同学使用。7. G-25 干胶用纸条少量多次加入，液层高约 0.5ml，离心后，管内凝胶倒入烧杯回收。8. 洗脱液收集无需分步，用载玻片检测蛋白，约每 5 滴检测一次，从开始出现白色悬浊液时开始收集，直至刚好不在出现白色悬浊液沉淀为止，所收集到的即为试验所需的蛋白质，本次试验不用纳氏试剂。9.滴加试剂等操作准确规范。不足1.实验过程中险些出现层析柱的上液层干涸现象，应时刻观察。2.收集蛋白因为视线受阻，时很难做到 1ml 一换管。另外层析速度过快，导致了收集过慢的现象，造成了收集的蛋白质较少。后来我们又对废液进行二次层析，造成蛋白纯度偏度。但从结果来看影响不是很大。
10、以后层析时应密切注意控制层析速度，3.做完凝胶层析后，其下方螺旋夹损坏。虽修复，但可能影响层析柱。4.我们组在进行离子交换层析时，发现滤过速度过慢，即使夹子开到最大，液体流出的速度仍旧很慢。本可以采用外加压力的方法进行层析即在层析上边用洗耳球外加气体压力使层析速度加快。此时注意的问题是不要在拿出洗耳球前松开洗耳球，否则由于洗耳球的吸力可能会将整个层析柱内的物质吸起来，严重影响层析的结果。5.加入 G-25 过多，导致试管内液体凝固不流动，第一次离心完全失败。在老师的建议下使用洗脱剂使其溶解再离心，成功提纯但浓度偏低。6.在进行离子交换层析纯化 -球蛋白时，长时间没有含蛋白质的溶液滴出。可能是前面已经进行过多次实验，层析柱中有堵塞等情况，影响其流出。7.镊子不干净，在夹取试纸时已造成小部分污染。
