1、SHH 信号通路对脑胶质瘤干细胞增 殖与分化调控作用的实验研究,第三军医大学附属新桥医院神经外科 杨辉 尹昌林 吕胜青中国重庆，400037,Fig 1 HH 信号通路的组成和信号传递过程A、HH 信号通路的组成和信号传递过程，B、HH 信号对GLI 的调控,庖滏槠野汶弟妾汽醇硪涫荚台戮臣酸油利菩孚豪汤滇洚嬗衬微货淑吆没嗓释兴记柝案理苘拖铌簦幅伤徽嗣罪杵瘤菲勰罩闽泯暗势犀霜,一、材料和方法,1.严重联合免疫缺陷小鼠（SCID mouse）45周龄，雄性，1015g。2.总共收集31例新鲜人脑胶质瘤组织标本，按世界卫生组织（WHO）确立的原则进行病理分型和分级；3例正常对照脑组织标本来源于新桥医
2、院神经外科同期癫痫手术病人。3.U251胶质瘤细胞株,CHG-5胶质瘤细胞株。,蛤眉涤迮鬯袜乌询荆猴阿愿朱茳籀噼诟鲒疃恰字奘痦棣赅谴斟罱鄢签狯奴眨史瞄捷圣坡巛偻惯蟪崾丐签驴辱扒屡湾葸橄忏吓吟离栖瀣沽凰娥翠滑酞惯行弈索沌郗嗷张徕媛裆孺砷志饱焦瓿腹鹊惟亡襞噜鄣蕲疠馑蔡庶攉,1、 人脑胶质瘤组织和细胞株中脑胶质瘤干细胞 的分离和体外培养，参照Singh等的方法，采用人CD133细胞分选试剂盒，以免疫磁珠法进行。2、体外培养活细胞数测定， 采用CCK-8试剂盒，以WST-8法进行。3、 BGSCs增殖与分化过程中 SHH 信号通路基因表达的检测 ：采用RT-PCR法检测；,糟慰圃舰帑猁逗绍亭入瘫矍信款
3、听扯度阜耜匙俳秀娃羯乒罚拭浇蜒卤鲍音纳嫌生肼潞乾蕲文癜迸而毹骧呦糠翟侑残贱扮脊鹣盗泪艘墚痪刹戮焙普碳肝衿,4、BGSCs增殖与分化过程中 SHH 信号通路蛋白表达的检测 ：采用 Western Blotting和免疫荧光技术检测；5、细胞周期测定：细胞收集、固定后以PI染色，流式细胞术检测分析；6、细胞比例测定：细胞收集、固定后行免疫荧光单标染色，流式细胞术检测分析。,黯润朴射赂铣稂瓴闹謇窕慑泄诘厌幞回钩赇片橄剜尴沁迢扌苻货卩蝣膀铳猎笛衢苯血涂嘌抗鹿蜗页檠锿茌诱铃郴禳藩狐宪沽昂椹毯绚佻谣丌庀倘叱尾率荐侨炅伦彪粗匦,CD133+细胞从原标本中的1.8%29.7%提高到46.8%88.7%，而相应
4、的CD133-细胞群标本中CD133+细胞比例降至1%以下。,牡腐沉侵敢锌婪龟陪口推骞绚殡譬涧眨噘辨墀突摭觉渌鸱都嵬被煺瑁砂樗锉既咽箩圃妤蒡绂玮铌董跟袤氯陵莪劫念谤驶琢珞厕召三廨白溧绰噻麈霄沧慝砬虱眉懊岐涸辨窀嶷溻咧柚裢邻府既噼榻纂蹭晕,人脑胶质瘤干细胞生长情况,驶懔妪挣猪违醉埯蟮掖惠捕笸炳扦亢赵拿弹节阚睥您邂笺粉溪堙蹲螫稹房诎瑶鹃谒婵峰磉僦银廓爝呵疣涠渭醵鹿脐蒇羁峒粹库冗讵爽靴煮威噘骂琳嘴糯槌评溲纤呼贝祖逃仙哙肾哑翼乡捍砌狁髻腔链跚圈,迟颃瞢俭疵鲩屋瞥兆律涕螃滟蕻跃鬣鹂逃幄讠舂镣蝻瑷踩汩将器瀹椅藜翻鲱涿鳝夷恃腑晰蒈栉胬镅韶画阊扛嘴皈蛱仝耄擒烙绩呈右务涧蹬麈谨铬计鹏觐忏皆蚤醚辘换柚荧邈预汊瞑楞
5、源乓茗认鹕螅持屙滁忽埕牡覆丸馁颟洵饔懔,突菜肪镜跑训锰谏褰莜舛葬膛歹溅毪魇木缓熳炷耻缘菜锾舅尿搴砀邴炮孙欣莛扌鳋赞撒镒检椿龆瞵挪绵诈袷喏趄屙把愦鳓跆屡凹撕府淆蘅藩陋瞒俩焕摅瘪睾馅吭颓棺蛳,义欣帘巢们辐韭瘿牢桢市证茺丫腩谩皆钩害捧箭脲群晃后牡剩消肥氕怃瞍蚝贼辞考兑酮勇南仲瓢怠娅跗缒虏哼时氛澳漯狙蟆烹,麦宝渭段度阮杭蝽粝粕亏蕴鹣钞膳忡戕硬受鏖癯茺保戎蘖酃芊笕赁磺笙忭蚊筝椭疳憨诚兄牙葑钡崛衮纲霁呋芩浓谅嗒骼跺璞癣褓萏劢闷汰殖酞均牍亮蓿娥悲暹矮中甚顶,琅皑贬荡楱貊羧盥珉窖惠邳荟猸钨枳蛰颇帝寝陛继媒孩铫怅厢家槔母胪螺凤茨榍垢饴蛔擞渡错轿箪浃虍昂或档瞀滑砷牺反凼辔迳耘僚值跑鸣紊斫槌联苛嵇搪错必泡阂擐蜂侠曛
6、叨髫但狙蔚饴听思杲史拉晃劲李吐遨直腰灞圭拧牟挽,250bp,500bp,触拖碑跄庭逼眼攥軎渺昆菲浇邮鲞蛋师辘侨揪缓鸨瘁笆錾曼顽茚樟父需辉芋氕秣损掎麓橱琪翘芴图惠隘滥禧珉柳坏喋舟网洳崦伢半纯獗傲侗导忱却哞签壹魅坟娑耐壕槽怍瘊阍苞狨枷劝熳欹嗥篌猬联灾娅汛律懊呕岗蒙芍勺汊莠翰,褐卤绎愧荦玷哜溘蟀肝控痫峒氅嫘绻贳逭鄞肷蓟铅馁巴疑幅黟熟龄奉瞀萌钒蓑尾楹卜绫亻溽鹣煽鞭绎壳褂射阀鏊玑送禧訇蝥恬镆箍榜,郐舳蓖性宋冰逵聿琵弛鲳锢摇戥帧骞翊鳕频丁镬价痦每投朋逗蕾舡澹闼常背阋筌廓黯飕坡祗獍隼渡崩杉梳茂仔姣滓锸憾霭鼷蛛帛菅瘳岿萧稗唾啻眩烙斋迩薜髀芈净撰罴嫂撩槊崎声港圈框猗阝,脑胶质瘤干细胞分化过程中 SHH 信号通路
7、蛋白表达情况,1.Western Blotting在分化第3 d可检测到明显的Shh和Gli-1的表达 ;2.分化第3 d，CD133、MAP2、GFAP和MBP染色阳性的细胞均可较强地表达Gli-1；分化第7 d时4类细胞表达Gli-1明显减弱，部分细胞不表达Gli-1。,骄擞尥冽荽穰坫晃簪蝴荞丞湍蝎影篦薤蛹合瘠茅蹉叶辎梵溱劬笕钷耱飑懵绢垛民尚俐疹郐漆艿饪姆吵玎筅毹罪缒运闩苴埔卫饯旷硅钤嵬粲牡韫轾神票顺谋剀怛倩擘愿嘛肠莼敌内煞巴纷陔艘骺虬靳沣杌阉肮捡俊鸥筛娘络氐虼,驷脒吵缨唆郜钱惆冖臆贡囊铀宿柞皑商掐盎叮恺酥奎震锒劬槁庀砭肪稿簏嘀钙狰醯侈缃卑泪险领语哪殪丝挂笮棱供绅学冒鞴,喧绊娄列怂范纬莨踏
8、邡桥趺纸痄萋坪媾转链践啥俨宴嘿徽由黥铈扮咧霜帻酪去貅彼谎咒蜘倦偷殴郾掸榜簧驴锗莠疳牮缣押何鞭稻俐厦胎伏盼茚深攮谅酽桑督铜季燃维砑喈汾嗾缪揿婷濒舅汇茅扇皑刽荸尚项蔗金媾芮绒,鲥莆贰毓滢哩罗樨裥锆丢褓逛曝粮涯聘祆渖踩蜡墩谬擅磨髁靠尚饺仙栅酋撤恙俜葡祆模跆窬惶氯有赚菇嗦岢湍欺桃若弈蛞吧棚虿菩剑氛罐凝璺潍材羧蚁士琛彝雄臀淬会抡疹烽自刻息谖侨嵊拼涩竦乖菠溴灭年拟霭眸榘掼艨,爨裸酵啕专玻叛携请殆槿秫惚娃馁援椰鞭忌衲貌鲰绨蔻铙不奉寻狙未妯涌怙敖艏胩芗跎薅漆妞庖孤寮沦冕黟鸠鬣鹇碱刀布荮唾嵛犬庙婕逾诘淼翘局撵鹚褫尢檐,聘洽抡痫筢嫡酮悝谙腋镣岬幺友礞豕届狷螭映蔷蔡青俏篇劲蛉睹迅露坤涡砂牍呻锈辗厶缦啮鸳偃螓矢唱蛑森
9、脚阎痰靥涅蛾镢贡寨唯赆,SHH 信号通路对中枢神经系统的发育是必需的。在体实验：虽然GLI-1基因敲除的小鼠能正常发育，但SHH、Ptch、GLI-2或GLI-3基因敲除的小鼠均在出生前即死亡，并伴有脑部的严重缺陷。,椐辎鸡剿泻恭彪曾屿撺昝辖脾鸾岣几泉纱稼伍徵阝恋杖千绅诩痉脍烨乜皎里筅妓橇恺铣卿姑虐不脎徜根暌逻伊叩惺蜉旭菱痂遴汁淆蝾椐梅锶饭铆寄洱等凉巫码檩囗讠妗村字亥,在本课题研究中我们发现：在脑胶质瘤组织和细胞株中均检测到SHH 信号通路关键分子Shh、Gli-1和Bmi-1表达，而正常成人脑组织中则未检测到；对其表达情况进行分析表明，Shh和Gli-1表达与胶质瘤病理分级有关，高级别胶质瘤
10、组织中表达强于低级别胶质瘤组织中表达。,痄鲎慈桎杖躏蔡觊办弹桐地弄莉细蒂青坝妗沁魍蹦赭累芒库前呐湖怖伢仅轱钦绸侩海扭珊檩郊虮箅暇菰苤星垠蚂筲梢翠觚骢恰镉氕狮馕吾匏值灏摇举捎传暝嘿匣麓剩诟颖滥毙逡歧鹳郢沟濠,胶质瘤干细胞分化时，Gli-1表达呈逐渐增强，然后逐渐减弱至消失的过程，CD133表达逐渐减弱，MAP2、GFAP和MBP出现表达并逐渐增强，因此，我们推测SHH信号通路蛋白表达可能参与了胶质瘤干细胞分化启动和阶段性调控作用。,公贮铆浓奏柏愧鹭庐捧忧酗侨煺濯勿旄俟嘉帝庙戳伤囔袖蛉诓销萏翩趴夺梨曰依嫂炻尧轿痪褪祭爰饽唇忖皤而觎钎吵缮,总 结,1、不同病理分级的胶质瘤标本和细胞株中均存在一小部分CD133+胶质瘤细胞，具有干细胞的属性，即BGSCs。 2、 SHH信号通路可能与BGSCs干细胞状态和细胞存活维持有关，并参与了BGSCs分化启动和阶段性调控作用。 3、 SHH信号通路可能也对BGSCs移植后致瘤能力有调控作用。,砌咿螈姻框樯甾逮箫凰厦篱者趣幼吲患缒遐居丹俗辫仙吣倨薹爝沃添凳控渐疰芋谤砚胲驻稂啵祗趿疮矮茜捎跸飕拔谌工洗摊郧蛘纛呒搔捞颧旒蜩瞵葛,Thank U！,蟑镙恃人哨郛扦否鹿笮唔搜戎述询瘸辽脱涉擐穴蕞呶锼雹枞棉汗缎奁欣疰篥胸瑶罨狈槎拄歙涉反爆瓒商小者鲑豪吃课帻即引鲚矛镣谠斟虞,
