1、临床免疫学检验部分抗血清的制备【原理】：用抗原刺激机体可以产生抗体，抗原的性质、纯度和活性影响其免疫动物后获得的抗体的的特异性和效价。在体外有目的的制备抗原，经初次、再次免疫的过程可以获得高质量的抗体。【注意事项】制备佐剂时，一定要顺着同一方向用劲磨。检查油包水的方法：培养皿内加水，滴入混匀液，不散开即可。如果第 1 次检查不合格，第2 次检查必须重新倒水在平皿。免疫动物皮内注射时，可以在足垫、腋下、 背部等处多点注射，总剂量 1ml/只。凝集反应颗粒性 Ag 或可溶性 Ag（Ab ）与载体颗粒结合成的致敏颗粒，与相应 Ab（Ag ）发生特异性反应。在一定条件下，形成肉眼可见的凝集现象。一、直
2、接凝集反应：颗粒性 Ag，与相应 Ab 直接结合。在一定条件下，形成肉眼可见的凝集现象。（1）玻片法凝集反应：【原理】：颗粒性 Ag（细菌、红细胞等），与相应 Ab 直接结合。在一定条件下，形成肉眼可见的凝集现象。【意义】：定性试验，可用已知抗体的诊断血清来测未知的抗原。可用于细菌分型、ABO血型鉴定等。【结果观察】：对照区不发生凝集，为均匀浑浊的乳状液。试验区，伤寒菌液（Ag）与相应的 Ab 发 生反应，出现肉眼可见的凝集块，为阳 性。 如与对照相同则为阴性。（2）试管法凝集反应：【原理】：用已知细菌作为一定浓度的悬液 Ag，与一系列稀释的受检血清混合，经静置保温后观察每管内颗粒性 Ag 的
3、凝集程度。【结果观察】：先看对照管，应无凝集现象，轻摇试管，细菌分散均匀， 混浊。再从第 1 管开始看。根据凝集度打“+”。： 管底无沉淀,液体混浊，细菌分散均匀。+： 管底有沉淀,上液澄清，细菌全部凝集。+： 管底有沉淀 ,液体稍混, 细菌 1/4 不凝集。+: 管底有沉淀 ,液体混浊，细菌 1/2 不凝集+: 管底仅少量有沉淀,液体混浊。效价判断：以出现“+”凝集的最大稀释度，为该血清的凝集效价。二、间接凝集反应：必须借助颗粒性载体，将可溶性 Ag（Ab）致敏载体，成致敏颗粒，再检测标本中相应的 Ab（Ag）。间接凝集反应（胶乳凝集抑制试验）：【定义】：间接凝集反应：将可溶性 Ag 挂在一
4、个无 关免疫的载体 (聚苯乙烯胶乳) 上，制备成颗粒 Ag,与其相应的 Ab 相结合 ,为间接凝集反应。以检测尿中 HCG 为例：阳性：尿含 HCG+抗 HCG +HCG 胶乳颗粒 不凝集阴性：尿不含 HCG+抗 HCG +HCG 胶乳颗粒 凝集沉淀反应【定义】：可溶性 Ag + 相应 Ab 形成肉眼可见的沉淀物质（Ag-Ab 复合物）一、对流免疫电泳【原理】：利用电场的作用加强和加快双向扩散的一种方法。在 pH8.6 的碱性缓冲液琼脂中进行电泳，带有较多负电荷的 Ag 泳向阳极，而 Ab 球蛋白等电点偏高（约为 6-7），在 pH8.6 时带负电荷较少，加上分子量较大，泳动慢，受电渗（指电场
5、中液体对固体支持物的相对移动）干扰后向阴极倒退，这样抗原抗体作相对运动，在较短时间内即可相遇，在孔间两者分子比例合适的地方形成沉淀线。【意义】： 对流免疫电泳主要用于检测标本中的抗原如 AFP、HBsAg 等。本法较双向琼脂扩散时间大为缩短（一般只需 30 分钟到 1 小时），且灵敏度比双扩高约数十倍。沉淀线的位置与 Ag、Ab 分子电荷情况有关，也与 Ag、Ab 比例有关。有沉淀线为阳性，无沉淀线为阴性。【特点】优点：操作简便，观察结果快，敏感度比双扩高 8-16 倍。缺点：分辨率差，当有多种 Ag、Ab 系统存在时，形成 的沉淀线位置易重叠，难以分辨，所以用此目的 时，不如双扩。 二、双向
6、琼脂扩散实验【原理】：定性试验。将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上相对应的孔内，抗原抗体从孔内向四周扩散，在两者对应比例适宜处形成沉淀线。【意义】：可用已知抗原（抗体）来检测未知的抗体（抗原），同时检测抗原抗体的纯度。临床上常用来检测甲胎蛋白（AFP），作为原发性肝癌等的辅助诊断。【结果判断】：在阳性对照孔与中间的抗体孔之间出现一条或多条白色沉淀线（一对抗原抗体系统即可出现一条沉淀线，如有多对抗原抗体可出现多条沉淀线）。观察标本孔与中间的抗体孔之间有无出现沉淀线，有即为阳性，无即为阴性。以上两实验的注意事项：浇琼脂板时注意动作要迅速，琼脂不要溢出玻片，成品琼脂板平整无气泡，打孔时，不要将琼
7、脂 划 破；加样时，不要溢出孔外；加样用的枪头不要混用。三、免疫电泳【原理】：区带电泳后进行双相琼脂扩散实验。将待测标本置于琼脂凝胶中电泳，样品中各蛋白成分因分子量及电泳迁移率不同，被分成肉眼不可见的若干区带。电泳结束后，沿与电泳方向平行的两侧开槽并加入抗血清，置室温或 37度使两者扩散。18-24h 后，各区带蛋白与相应的 Ab 在相应的位置上形成弧形沉淀线。Ag 越多，沉淀线越靠近 Ab 槽，其沉淀线越粗，可做细微的蛋白质组分分析，仅为定性实验。【用途】：定性实验，主要用于纯化 Ag 和 Ab 成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别和鉴定等方面。注意事项：开槽处距玻片边缘5mm,开孔处7.
8、5mm。槽中加抗血清时，加满即可，切忌溢出。四、单向琼脂扩散电泳【原理】：单向琼脂扩散扩实验是凝胶内免疫沉淀反应定量试验。一般是用已知抗体测定未知量的相应抗原。定量抗体与加热熔化的含缓冲液的琼脂混合后，制板，打孔，加入待检抗原，在合适条件下，形成乳白色的沉淀环。沉淀环大小与抗原（抗体）量成正相关，因而可以根据沉淀环的大小确定相应抗原（抗体）的量。【意义】：单向免疫扩散试验主要用于血清中 IgG、IgM、IgA 和补体等蛋白质的定性、定量测定。以上两实验的注意事项：制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制。温度太低会导致琼脂凝固，太高将影响所加抗体的活性。加样孔中的琼脂应挑干净，且不可损坏孔的边缘
9、，确保每孔的液面基本一致。ELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）该技术基础是抗原或抗体固相化和酶标记的抗体或抗原，固相化和酶标记的抗原抗体仍保持其免疫活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量有一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。常用的 ELISA 的方法有：间接法、夹心法、竞争法
10、乙肝两对半：乙型肝炎病毒抗原 人体产生的相应抗体HBsAg HBsAb 、 HBeAg HBeAb 、(HBcAg) HBcAb大三阳 ：HBsAg ，HBeAg，HBcAb 阳性。 小三阳 ：HBsAg，HBeAb，HBcAb 阳性。【实验目的】：定性或定量测定人血清或血浆中乙型肝炎病毒表面抗体（抗 HBs),可用于判断乙型肝炎疫苗接种效果和乙型肝炎病毒感染的治疗效果和预后情况。【实验原理】：双抗原夹心法检测人血清或血浆中的抗-HBs（一步法）。采用纯化 HBsAg 包被反应板，加入待测标本，同时加入 HBsAg-HRP 进行孵育，当标本中存在抗-HBs 时，该抗体与包被 HBsAg 结合并
11、与酶结合物形成 HBsAg抗 HBsHBsAgHRP复合物。洗去游离反应物，加入显色剂后，将有明显颜色变化。若标本中无抗-HBs 时，加入底物后没有或只有很轻微的颜色变化，在一定范围内，颜色的深浅变化与标本的含量呈正比。【结果判断】未加终止液前，阳性孔呈蓝色，阴性孔和空白孔无色，标本孔如呈蓝色即为阳性，颜色深浅与标本中的抗 HBs 量呈正比。加终止液后，蓝色转为黄色，放入酶标仪中检测，使用 OD450-492nm 波长测定 OD 值，计算 cutoff 值，读数需在终止反应后分钟内完成。cutoff 值：=阴性对照平均值.标本值为阳性，标本值 为阴性。阴性对照值低于 .，作. 计算，高于.按实
12、际值计算。免疫荧光色素技术许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：异硫氰酸荧光素（FITC）：为黄色或橙黄色结晶粉 末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为 490-495nm，最大发射光波长 520-530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。四乙基罗丹明；四甲基异硫氰酸罗丹明等。【实验原理】：利用荧光标记第二抗体检测未知 Ag 或未知 Ab 的方法。以检测人血清中抗核抗体（AN
13、A）为例。小鼠肝细胞作为抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有 ANA，就会与细胞核成分发生特异性结合，再加入荧光素标记的抗人 IgG 又可与 ANA 结合，在荧光显微镜下细胞核部位呈现荧光。以检测血清中 ANA(抗核抗体)为例。鼠肝细胞 + ANA（1：5 血清），一抗 + 抗人 IgG-FITC，二抗 荧光显微镜下观察 无荧光为阴性，有荧光为阳性【实验结果】细胞核发黄绿色荧光为“+”，阳性待检血清作进一步稀释后可测定效价。不发荧光为“-”。根据细胞核着染荧光的图像，可区分为：均质性：细胞核呈均匀一致的荧光。周边性：核周呈现荧光。斑点型（颗粒型）：核内呈现斑点状荧光。核仁型：核仁部分
14、呈现荧光。混合型：两种以上核染色。【注意事项】：抗原片要新鲜，厚薄一致，要尽量薄。待检血清要新鲜。冲洗时要干净，动作要轻柔。观察结果要及时，以免荧光湮灭。补体 CH50 实验【实验原理】：补体与抗体（溶血素）致敏的羊红细胞接触后，被激活（C1 途径），从而使致敏的 SRBC 溶解，其溶血程度与补体量呈正比。因此，将新鲜待检血清做不同稀释后，与致敏红细胞反应，测定溶血程度，以 50%溶血时的最小血清量判定终点，可测知补体总溶血活性。以 50%溶血判断结果比 100%溶血灵敏、准确。溶血素+SRBC ，在补体的作用下 溶血【实验结果】对照管不溶；目视比较，最接近标准管的一管。根据 U 管中加入的血
15、清量，求出总补体值：补体活性（u/ml）=1/血清量（ml）稀释倍数（20）无法目测的，用 722 在 542nm 处读 T 值也可。大小吞噬实验【实验目的】：体内具有吞噬功能的细胞称为吞噬细胞，主要包括血液中的中性粒细胞、单核细胞和组织中的巨噬细胞。通过测定细胞的吞噬率、吞噬指数可了解吞噬细胞的吞噬功能。一、小吞噬试验【实验原理】：中性粒细胞具有很强的吞噬杀菌功能，当与颗粒性物质（细菌等）混合孵育一定时间后，颗粒性物质被吞噬杀灭。根据吞噬率、吞噬指数可反映该细胞的吞噬功能。【结果观察】：镜下可见 RBC 被染成红色，其它为蓝色，找到中性粒细胞，计算吞噬率及吞噬指数。吞噬率（%）= 200 个
16、中性粒细胞中吞噬细菌的细胞数/200100%吞噬指数= 200 个中性粒细胞中吞噬的细菌总数/200二、大吞噬试验【实验原理】：血液中的大单核细胞游走至组织中形成 巨噬细胞，有吞噬颗粒性物质的功能。【实验结果】：镜下可见梭形鸡 RBC 被巨噬细胞吞入胞浆内。【注意事项】：、5%淀粉的作用：注射豚鼠后，诱导血液里 的单核细胞进入组织里，变成巨噬细胞。、5%鸡 RBC：有核，梭形，染色后核为蓝 色，周围为红色。、巨噬细胞在吞噬后形态会不规则，不易找到；所以可先找到有核的鸡 RBC，看是否被其他细胞包裹。如果包裹物也有核，则为巨噬细胞。PFC（溶血空斑形成试验）【定义】：溶血空斑形成试验是一种体外检
17、测单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。故又称体外抗体形成细胞测定技术。【实验目的】：测定抗体生成细胞功能（B 细胞产生抗体的能力）。【实验原理】：将经 SRBC 免疫过的小鼠脾细胞与一定量的 SRBC 混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围那些受到抗体分子致敏的绵羊红细胞溶解。抗体生成细胞 （已致敏）+ Ag(SRBC) + 补体 溶血【结果判断】取上清，722 上 413nm 比色，检测上清中 SRBC 裂解释放的血红蛋白量（以OD 值反映补体溶解 SRBC 的程度）。 淋巴细胞功能测定系列实验一、淋巴细胞分离实验淋巴细胞成功分离后，便于在体外对机体免疫细胞进行鉴定、计数或功能测定；还可以用于
18、 E花环试验、淋巴细胞转化试验及淋巴细胞培养（需无菌操作）。淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，纯度较好，失活较低。无论采用哪种方法，应最大可能保持细胞应有活性。【原理】：分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。本实验采用的是密度梯度离心法。该方法是根据各类血细胞比重的差异（外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为 1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为（1.0740.001 ），利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液（等渗的聚蔗糖-泛影葡胺， Ficoll）对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯
19、度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。二、E 玫瑰花环形成试验【原理】：人 T 淋巴细胞表面的 CD2 分子即绵羊红细胞受体（ER），在一定的实验条件下，可与绵羊红细胞（SRBC）结合，形成玫瑰花结，称为 E 玫瑰花环试验(erythrocyte-roseette formation test)。该试验常用于临床检测人外周血 T 淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况。 总 E 花环和活跃花环：淋巴细胞与 SRBC 在 4 环境作用 2h 以上形成花环，代表外周血中 T 细胞总数占淋巴细胞的百分比，成为总 E 花环实验（Et）。 如果两种细胞悬液混合后，不经 37和 4
20、 作用立即反应仍有部分淋巴细胞形成花环，称为活跃花环（Ea），代表对 SRBC 亲和力高的一个 T 细胞亚群。总花环实验（Et 花环）实验结果计数花环个数，结合 3 个以上的 SRBC 为一个花环，计数 200 个淋巴细胞，计算 E 花环形成率，正常值为 50%-80%。E 花环形成率 形成花结的淋巴细胞数 / 淋巴细胞总数 （形成花结+未形成花结） 100 %活跃花环试验（Ea 花环实验结果）Ea 花环的结果代表 T 淋巴细胞中一类亚群，计数花环个数，结合 3 个以上的 SRBC 为一个花环，计算 E 花环形成率，正常值为 20%-30%。E 花环形成率形成花结的淋巴细胞数 / 淋巴细胞总数
21、 （形成花结+未形成花结） 100 %三、T 淋巴细胞转化试验【原理】：T 淋巴细胞与许多特异或非特异抗原在体外共同培养时，细胞的代谢和形态可以发生一系列的变化：细胞形态向淋巴母细胞的转化；电荷的改变；细胞内蛋白质和核酸合成的增加。【结果观察】：转化细胞：淋巴母细胞：体积大，核膜清楚，染色质疏松呈细 网状，核/细胞比例变小。过渡型淋巴细胞：类似母细胞。核丝分裂相细胞：核体呈现有丝分裂，胞内可见组织染色体。未转化细胞：成熟小淋巴细胞：体积小，核染色体致密，核/细胞比例大。转化率计算：转化率转化的细胞数/淋巴细胞总计数 100 %计数 200 个淋巴细胞，评价标准： 60-80%为正常，50-59
22、%为偏低，50%为降低。体外刺激物种类：非特异抗原刺激物：如 PHA、ConA 等特异性抗原刺激物：如 PPD细胞抗原和抗淋巴细胞抗体：如同种白细胞、抗淋巴细胞血清等四、淋巴细胞增殖实验（MTT 法）【原理】：MTT 比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性
23、因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。五、细胞因子的测定（ELISA）T 细胞在受到非特异性有丝分裂原（PHA/CohA）刺激后，或者特异性抗原刺激被激活后，其形态和代谢产生一系列变化，会产生很多细胞因子。培养 72 小时的淋巴细胞上清液，用 ELISA 的方法测定上清中的 IL-2 的含量。【原理】ELISA 竞争法：先用特异性抗体（抗 IL-2 Ab）包被固相载体，然后同时加入待测抗原（上清液中的 IL-2）和酶标记的抗原（酶标的 IL-2），待测样本中的抗原与酶标记抗原竞争性的与固相载体上的特异性抗体结合，温育一段时间后洗涤，加入底物显色，测定其 415nm 处的 OD 值。为了定量，还应做一系列标准品，测定其 OD 值并绘制标准曲线，根据 OD 值在曲线上查出其对应的 IL-2 含量。
