1、技术研究总结 二 （参考格式）子课题名称：食蟹猴生理生化学的研究一、研究工作总结摘要首次比较全面地研究了用 阴茎电刺激采精法对食蟹猴进 行电刺激采精、精液特征、用计算机辅助精液分析系统对精 液进行分析，搞清了电刺 激参数电压，频率，波宽和电刺激时间；精子的活力和密度；扫描电镜下精子形态；平均死活精子率，平均精子畸形率，平均精子顶体异常率。首次比较全面地研究了精液稀释液在常 温、低温和生理温度三种状态下保存精子的存活时间，存活 指数和最佳配方。首次比较全面地研究了雌性猴阴道涂片动态细胞图像变化，月经周期宫颈粘液氯化钠浓度的变化，正常雌性猴和因肥胖不孕雌性猴月经周期雌二醇和孕酮的 分泌特点。研究了
2、食蟹猴 人工授精和同期 发情的和超数排卵和收集卵子的方法。二 、 研究工作总结1. 研 究 内 容 及 研 究 方 法 。1） 、人工采精方法: 以电刺激法采精，探讨最佳成功采精方法。2） 、精子性状指标测定包括：精子活力, 精子畸形率，精子浓度等性状以及精子的形态结构特点。本实验采用计算机辅助精液分析系统对食蟹猴精液进行分析。3） 、精液的处理与保存：测定精液稀释液在常温（1525） 、低温（05）和生理温度（37）三种保存方法的精子活力、时间和最佳配方。4)、食蟹猴排卵期的测定方法。食蟹猴阴道涂片的动态观察；宫颈粘液 NaCl 浓度法测定食蟹猴排卵期的研究；用基础体温和基础体重法测定食蟹猴
3、排卵期的研究。5)、雌性食蟹猴月经周期雌二醇和孕酮分泌水平的研究。6） 、超数排卵方法: 采用以下超数排卵方法对供体进行试验： 孕激素+孕马血清（PMSG）或卵泡促激素（FSH）的超排方法； PMSG 或 FSH+前列腺素（PGS）的超排方法；7） 、受体动物选择和同期发情处理: 受体动物应是健康、营养良好、生殖机能正常的雌猴；安排 120 只猴子进行氯前列烯醇肌肉注射法的试验，同时进行了氯前列烯醇的阴道栓法的试验。并同时对发情的食蟹猴进行人工授精实验。8） 、胚胎移植技术研究：采胚方法: 拟采用非手术内窥镜腹部穿刺采胚。胚胎移植方法: 采用手术法进行输卵管内移植 4-8 细胞胚胎和子宫内移植
4、桑椹胚或囊胚。胚胎冷冻方法: 摸索不同的冷冻液, 冷冻防护剂和降温速度. 拟参照家畜胚胎常规冷冻方法或玻璃化冷冻方法。 2. 简 要 说 明 主 要 的 科 学 发 现 和 创 新 之 处 ， 并 列 出 具 体 的 内 容 和 必 要 的 数 据 。（1）食蟹猴电刺激采精及精液生物学的初步研究。、科 学 发 现 和 创 新 之 处 ： 首次比较全面地研究了用阴茎电刺激采精法对食蟹猴进行电刺激1采精。结果：电刺激参数设为电压 3256V，频率 2530Hz，波宽固定为 10ms，电刺激时间110s，食蟹猴在非麻醉情况下成功采精，采精量为 0.200.16mL。在采精过程中没有发现阴茎损伤。、科
5、 学 发 现 和 创 新 之 处 ： 首次比较全面地研究了食蟹猴精液特征。对食蟹猴精液特性进行了初步研究，结果发现精子的活力为 88.379.33，精子密度为 2169.791922.38106个/mL。用扫描电子显微镜观察发现食蟹猴精子的特点是头部长径比较短而显两端较钝圆的卵圆形，长5.060.28m，宽 3.170.20m；尾部中段长 10.360.36m，主段和末段长51.61.52m。平均死精子率为 9.1，平均畸形率为 13.1，平均顶体异常率为 3.3。、科 学 发 现 和 创 新 之 处 ： 首次比较全面地研究了用计算机辅助精液分析系统（CASA）对食蟹猴精液进行分析。目的：用计
6、算机辅助精液分析系统（CASA）对食蟹猴精液进行分析，以揭示食蟹猴的精液生物学特性，为在人工饲养食蟹猴的繁殖实践中进行精液品质鉴定提供相关的测定数据。方法：采用 CASA 系统对 29 例雄性食蟹猴精液样本进行分析。结果：（l）静态特性：食蟹猴的精子密度为 2134.532052.87M/mL；活动精子密度为 1955.361939.59M/mL，活动精子百分率为88.799.09%；前向运动精子密度为 1263.981271.13M/mL，前向运动精子百分率为59.5816.43 %；快速相细胞百分率为 82.7613.10 %。 （2）动态特性：精子活动性检测：食蟹猴精子的平均路径速度为
7、133.7858.22m/s，直线速度为 121.4356.64m/s，曲线速度为169.7852.39m/s，精子头侧摆幅度为 4.190.72m，平均摆跨频率（鞭打次数）为29.794.30Hz，前向性为 84.625.46，直线性为 63.6213.07。精子活力分级：食蟹猴精子的快速相浓度为 1844.971875.96M/mL，百分率为 82.7613.10；中等相浓度为110.18139.33M/mL，百分率为 5.935.26；慢速相浓度为 85.74144.32 M/mL，百分率为3.622.90；静止相浓度为 93.9972.85 M/mL，百分率为 7.698.20。 （3
8、）精子形态参数：食蟹猴精子的头长比为 61.934.4.14；头部面积为 7.331.22（msq） 。、食蟹猴精液常温和低温保存测定在常温（1525） 、低温（05）和生理温度（37）三种状态下食蟹猴精子在精液保存液中的存活时间，存活指数；研究食蟹猴精液保存液的最佳配方。结果：（1）在生理温度（37）和常温（1525）时，食蟹猴精子在 TALP 保存液中的存活时间分别为 12.945.57h, 58.5940.91h；存活指数分别为 4.881.97，24.4817.94。 （2）低温 05时，食蟹猴精子在（TALP20蛋黄）保存液中存活时间为 52.674.12h，在低温保存液 1 中存活
9、时间为142.3335.59h,在（TRIS20蛋黄）保存液中存活时间为 59683.35h，并经方差分析， 它们的差异具有显著性（p0.01） 。 （3）低温 05时，食蟹猴精子在（TALP20蛋黄）保存液中的存活指数为 22.493.91, 在低温保存液 1 中的存活指数为 87.6215.53,在（TRIS20蛋黄）保存液中的存活指数为 283.0549.42，并经方差分析，它们的差异具有显著性（p0.01） 。结论：根据以上结果提示，在本实验中，食蟹猴精液在低温 05保存时， （TRIS20蛋黄）保存液为最优配方；在生理温度（37）和常温（1525）保存时， TALP 保存液对食蟹猴精
10、液处理、保2存效果良好。（2）食蟹猴排卵期的测定方法。、科 学 发 现 和 创 新 之 处 ： 首次比较全面地研究了雌性食蟹猴阴道涂片动态细胞图像变化。本试验的目的是，为食蟹猴实施人工授精和适时配种提供一种有效的测定排卵期的方法。选择46 岁性成熟的雌性食蟹猴 30 只，对其阴道涂片进行动态观察。结果表明，食蟹猴阴道涂片中主要有角化上皮细胞、中层基底细胞、白细胞和细胞碎片等。说明白细胞数各时期差异均具显著性（ P0.05） ；角化上皮细胞在月经前期和月经期没有差异，但其它各期差异具显著性（ P0.05） ；月经期和月经后期中层基底细胞数目变化差异不显著，但其它各期差异具显著性（ P0.05）
11、；月经前期和月经期的细胞碎片数目相似，但其它各期差异具显著性（ P0.05） 。各时期细胞成份变化规律是，角化上皮细胞从月经期到排卵期呈逐渐增加至最高，然后逐渐减少；而白细胞、中层基底细胞和细胞碎片则恰好相反。、科 学 发 现 和 创 新 之 处 ： 首次比较全面地研究了月经周期宫颈粘液 NaCl 浓度的变化以及基础体温和基础体重的变化。目的: 为人工养殖食蟹猴提供一套有效的确诊雌性食蟹猴排卵期的方法。方法: 选用广西壮族自治区营林开发中心实验动物基地 30 只 46 岁健康雌性食蟹猴，利用硝酸银（AgNO 3） 、氯化钠（NaCl）与铬酸钾（K 2CrO4）的显色反应测定它们宫颈粘液 NaC
12、l 浓度的变化，同时每天观察记录它们性体征的变化，测定天数为至少一个月经周期。结果：有 25 只占 83.33的雌猴的阴道粘液 NaCl 浓度最高达 0.9，其中雌猴 NaCl 浓度变化呈规律的曲线，宫颈粘液鉴定法测得雌猴的月经周期长度为 26.443.14 天。、用基础体温和基础体重法测定食蟹猴排卵期的研究方法：选 30 只 47 岁健康雌性食蟹猴，单独放置在特定的笼舍内饲养 1 周，待应激基本消失后，每天清晨 8：00 测量它们的基础体温（BBT） 、基础体重及观察记录它们发情的体征以及阴道分泌物的情况。测定时间为一个月经周期。同时每天记录笼舍环境温度。结果：（1）雌性食蟹猴黄体期基础体温
13、比排卵日的基础体温高 1.530.45。具有明显发情排卵特性体温曲线的有 16 只，占 53.33%。 （2）雌性食蟹猴排卵日体重平均增加 0.40 kg0.18kg，达 11.865.82。（3）雌性食蟹猴月经周期雌二醇和孕酮分泌水平的研究。科 学 发 现 和 创 新 之 处 ： 首次比较全面地研究了正常雌性食蟹猴和因肥胖不孕雌性猴月经周期雌二醇和孕酮的分泌特点。本试验目的是弄清雌性食蟹猴月经周期雌二醇和孕酮的分泌水平，以及因肥胖不孕雌猴雌二醇和孕酮的分泌特点。试验随机选用可繁雌性食蟹猴 30 只，每天观察记录其性皮肤变化和阴道分泌物的情况，然后从中选择 10 只性皮肤和阴道分泌物均较明显显
14、示发情的雌猴，每天采取血清样本，然后用荧光偏振免疫分析法测定雌二醇和孕酮的含量，同时每天观察并记录性皮肤和阴道分泌物变化情况，依据性皮肤和阴道分泌物变化来确定性周期，并以性周期的天数为采血天数，然后对结果进行分析。结果表明，可繁雌性食蟹猴的雌二醇变化范围为320.4011926.5013.69pg/mL，孕激素的变化范围为 7.263.330.620.08ng/mL，月经周期的第 21.387.3 天为雌二醇峰值和第 29.387.19 天为孕酮峰值。食蟹猴的月经周期天数为336.45.97 天，黄体期天数为 14.31.11 天，滤泡期天数为 22.12.28 天，其中行经天数为34 天。同
15、时对因为肥胖无法怀孕的雌性食蟹猴 8 只进行对照试验，结果表明，其雌二醇变化范围为 9560.44137.39pg/mL，孕激素的变化范围为 0.700.410.100.09ng/mL，其雌二醇的峰值和孕酮的峰值与正常可繁雌猴相比差异显著（p0.05） ，其雌二醇的最低值和孕酮的最低值与可繁雌性猴相比差异不显著（p0.05） ，说明肥胖雌猴本身生殖激素的内分泌已经紊乱，由此可以推测因肥胖引起生殖激素内分泌紊乱是导致不孕的原因之一。（4）超数排卵方法: 采用以下超数排卵方法对供体进行试验孕激素+孕马血清（PMSG）的超排方法，本实验利用 12 只雌猴进行试验，结果为采集到的卵子分别为 25 枚。
16、FSH+前列腺素（PGS）的超排方法，本实验利用 12 只雌猴进行实验，结果为采集到 28 枚卵子。从以上结果可以看出利用以上 2 种方法进行超排均能采集卵子。（5）同期发情处理和人工授精试验:安排 120 只猴子进行氯前列烯醇肌肉注射法的试验，同时进行了氯前列烯醇的阴道栓法的试验，结果发现 2 种方法的同期发情率分别为 36和 41，发情率达不到预期效果，可能是食蟹猴对氯前列烯醇的感应性较低的缘故。选择以上实验发情的食蟹猴 12 只进行人工授精实验，利用经过上述电刺激采精方法采集的精液进行人工授精实验，结果有 6 只成功怀孕。3. 计 划 （ 如 有 变 动 ， 须 说 明 ） 的 完 成
17、情 况 与 存 在 的 问 题 。本 课 题 除 了 胚 胎 冷 冻 保 存 试 验 部 分 未 完 全 按 照 计 划 进 行 外 ， 其 余 试 验 均 按 照 计 划 完 成了 研 究 ， 而 且 在 试 验 过 程 中 发 现 ， 食 蟹 猴 的 繁 殖 生 物 学 研 究 在 国 内 才 刚 刚 起 步 ， 如 果 要 进行 食 蟹 猴 的 人 工 授 精 、 胚 胎 移 植 等 技 术 研 究 必 须 弄 清 食 蟹 猴 的 生 理 周 期 特 性 ， 同 时 考 虑 到 猴 场的 生 产 实 践 需 要 ， 据 此 本 实 验 及 时 调 整 了 部 分 研 究 内 容 ， 即
18、增 加 了 食 蟹 猴 的 食蟹猴排卵期的测定方法和雌性食蟹猴月经周期雌二醇和孕酮分泌水平等两部分的研究内容，并已将成果利用到了猴场的生产实践中。6三、完成论著目录主要作者 论著名称备 注（请注明：论文发表的刊物名称，日期，卷（期） ，起止页码；或著作的出版日期，出版社名称，出版社地址）黎宗强，卢克焕，谢莉萍等黎宗强，谢莉萍，陈敏等黎宗强，卢盛晟，谢莉萍等黎宗强食蟹猴阴茎电刺激采精及精液特性的初步研究。食蟹猴阴道涂片的动态观察。雌性食蟹猴月经周期雌二醇和孕酮分泌水平的研究。食蟹猴繁殖生物学的初步研究广西农业生物科学，2004 ，23 （4） ，238242中国实验动物学报，2005， 13（1） ，3337中国医学研究与临床，2004， 15（2）：1 6博士学位论文7附表：科学基金项目资助经费终结决算表项目名称 食蟹猴繁殖生物学特性的研究合同编号结题种类（选填字母 A.正常 B.中止 C.撤销 D.提前） A批准资助金额（元） 200，000累计拨入经费（元） 200，000合 计1、科研业务费 20，0002、实验材料费 160，0003、仪器设备费 04、实验室改装费 05、协作费 0经费支出（元）6、管理费 10，000经费结余（元） 00
