1、 生物技术实验报告姓名：张龙龙学号：2011506066班级：11 级生技 02班前言：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb；GFP 是由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为 27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60处理。1996 年 GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 n
2、m，由 11 个围绕中心 螺旋的反平行 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第 65-67位的 Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成. 一.实验目的1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。3、掌握 PCR、DNA 片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA 样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。 二实验原理基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的 DNA 片段，这种DN
3、A 片段被称为“目的基因” ；二是将目的基因与质粒或病毒 DNA 连接成重组DNA；三是把重组 DNA 引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP 基因从含 GFP 基因的质粒中扩增出来。再利用双酶切切开表达载体pET23b 和目的基因的两端接头，通过 T4 连接酶 GFP 基因与表达载体重组。将含 GFP 基因的重组表达载体导入宿主菌 BL21(DE3),在 IPTG 的诱导下，使 GFP基因表达3. 实验材料及仪器1、实验材料：含有 GFP的质粒；DNA Marker；DH5；BL21；2、仪器：恒温培养箱
4、、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR 仪、PCR 管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml 离心管。四.实验内容4.1 质粒的提取、酶切及电泳鉴定：1) 实验试剂：LB 培养基；溶液；Tris-HCl（pH=8）；溶液；溶液；酚/氯仿抽提液；无水乙醇；电泳缓冲液；加样缓冲液；GoldView核酸染色剂；1%的琼脂糖凝胶；Xho(10U/l)；Nde（10U/l）；T4 DNA lisase。2) 实验步骤：质粒的提取与鉴定（1）在含有质粒的 DH5 平板菌落上挑取单菌落，接种于 20ml含有
5、100l /ml Apm的 LB液体培养基中，37、200rpm 振荡培养过夜。（2）分装菌液到 1.5ml离心管中，冰浴 2min。4、12000rpm 离心 5min，收集菌体，弃上清。再用同样方法收集一次菌体。（3）将细菌沉淀重悬于 100l 预冷的溶液中，涡旋剧烈振荡 ，混匀，冰浴10min。（4）加 200l 新鲜配制的溶液，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管 5次，充分混匀，冰浴 5min。（5）加入 150l 预冷的溶液，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管数次，使溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置10min。4、12000rpm 离心 10min。 （6）加等体积
6、的酚/氯仿（1：1），震荡混合有机相和水相，冰浴 3min。4、12000rpm 离心 10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中。（7）加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），振荡混合有机相和水相，4、12000rpm 离心 10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中。（8）加入 2倍体积预冷的无水乙醇，-20沉淀 DNA 10-20min。4、12000rpm 离心 10min，弃上清，留沉淀（管底有少量白色沉淀）。（9）分 2次加入 1ml预冷的 70%乙醇洗涤沉淀， 12000rpm 离心 5min，抽吸去除所有上清，放置室温干燥，让酒精挥发。（10）加 30l TE（内含浓度 50g
7、/ml 的 RNase A）溶解 DNA，37放置30min，消化 RNA。-20保存备用。（11）制 1%的琼脂糖凝胶：加 25mlTAE缓冲液于三角瓶。称取 0.25g琼脂糖加到三角瓶中，与微波炉加热至完全溶化。冷却至 60左右，加 1l 的GoldView溶液，摇匀。轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30min以上。轻轻拔掉梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（TAE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约 1mm。（12）点样：取 5l 质粒 DNA及 2l 加样缓冲液混合上样，80100v 约电泳2030min。质粒 DNA的酶切（1）酶切：按如下双酶切体系（20l）混合反
8、应物 质粒 5l 3lXho(10U/l) 0.5l 0.5lNde（10U/l） 0.5l 0.5l10buffer 2l 2lddH2O 12l 14l先加水，再加 buffer，加质粒，加内切酶，放离心机上混匀。在 37水浴4h。（2）电泳，在紫外观察分析仪上观察酶切结果。 4.2目的基因的获得和重组载体的构建1) 实验试剂：模板 DNA；dNTP；Taq DNA聚合酶；引物；10buffer（内含 Mg2+）；ddH 2O；10T 4DNA连接酶 buffer；T 4DNA连接酶。2) 实验步骤：目的基因的获得、检测及回收（1）依次混匀下列试剂：反应体系ddH2O 9.5 lMix 1
9、2.5 l上游引物 1 l下游引物 1 l模板 1 l混合后瞬时离心。（2）PCR 反应程序94 预变性 3 min94 变性 30 sec52 退火 30 sec 30 个循环72 延伸 1 min72 延伸 1 min4 （3）电泳：扩增产物用 1% 的琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。（4）用干净的刀片将需要的 DNA条带从凝胶上切下来，称取重量。（5）以 0.1g 凝胶对应 300l 的体积加入 PN。（6）50 水浴 10min ，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全溶解。（7）将上一步的到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管中，13000rpm 离心 60s，弃掉废
10、液。（8）加入 800l 漂洗液 PW，13000rpm 离心 60s，弃掉废液。（9）加入 500l 漂洗液 PW，13000rpm 离心 60s，弃掉废液。（10）将离心吸附柱放回收集管，13000rpm 离心 2min。（11）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液 EB 30l，洗脱缓冲液在 65水浴中预热，室温放置2min，13000rpm 离心 1min，然后将离心的溶液重新加回到离心吸附柱中，13000rpm离心 1min。（12）电泳检测回收产物，余置于-20保存。重组质粒的连接将 PCR扩增的目的基因片段产物与 PGM-T载体连接。反应体系（
11、l）如下；体系成分 体积（l）溶液 5PGM-T载体 0.2目的基因产物 4.8 将反应液混合，16 30 min。4.3感受态细胞的制备及转化1) 实验试剂:LB 培养液；0.1mol/L CaCl2溶液； E.coli DH5 受体菌（R -M-）；LB 培养基；氨苄青霉素；IPTG；X-gal。2) 实验步骤 感受态细胞的制备（1）活化 E.coli DH5 菌株：将实验室保存的 E.coli DH5 菌株甘油管用无菌去离子水 1:100稀释后，平板划线法接种在无抗生素的 LB固体培养基上，37培养过夜，见有菌落长出，用接种环从平板上挑取一个单菌落，接种到20ml无抗生素的新鲜 LB液体
12、培养基中，37、200rpm 振荡培养过夜。（2）按照 1%接种量，从上述培养液中吸取菌液 2ml，转接入 200ml新鲜的无抗生素的 LB液体培养基中，37、200rpm 振荡继续培养至 OD400值为 0.3-0.5左右。（3）在已灭菌的 10ml离心管总吸取上述培养液 10ml，冰浴 20min 后，4、6000rpm离心 10min，收集菌丝，弃上清。（4）加 2ml冰预冷的 0.1mol/L CaCl2溶液，重悬菌体，冰浴 10min。4、6000rpm离心 10min，收集菌丝，弃上清。（5）将每一份沉淀轻缓的悬于 0.4ml冰预冷的 0.1mol/L CaCl2溶液中，轻轻重悬菌
13、体沉淀。冰上放置 10min。（6）分装 100l/管（冰浴分装），置-4冰箱保存。连接产物转化感受态细胞（1）转化用固体 LB培养基平板的制备向含有 100g/ml 氨苄青霉素（Amp）的固体 LB培养基平板上加50mg/ml的 IPTG 16l 和 20mg/ml的 X-gal 40l ，用灭菌涂布棒涂布均匀，37避光倒置 3 h，让溶解 X-gal的二甲基酰胺尽量挥发干净。加入 IPTG和 X-gal的转化用平板应避光保存，以防试剂见光分解。（2）连接产物转化 E.coli DH5 感受态细胞去 5l 连接产物加到 100l E.coli DH5 感受态细胞（从-70冰箱取出放于冰上，带
14、钢解冻加入连接产物）中，轻弹混匀，冰浴 20min。取出离心管，42水浴热击 90s，立即置冰浴中冷却 3min。向离心管中加入 900l 37预热的无抗生素的 LB液体培养基，混匀后，37、200rpm 振荡培养 1 h，复苏菌体。取出离心管，6000rpm 离心 2min，弃上清 800l，用剩余的月100l 上清液将沉淀菌体吹打混匀后，加到含 100l/ml 氨苄青霉素（Amp）的 IPTG和 X-gal的 LB固体培养基平板上，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀。放在室温直至液体吸收。倒置平板，37恒温培养 14-16h，直至长出单菌落。4.4重组子的筛选鉴定1) 实验试剂：dNTP；Taq 聚
15、合酶；引物；10buffer（内含 Mg2+） ；ddH2O ；Nde；Xho；Apm；LB 培养基2) 实验步骤重组质粒的 PCR鉴定（1）挑取单菌落：使用无菌枪头挑取 5个白色单菌落，放入内含有氨苄抗生素的 LB液体培养基的 1.5ml离心管中，振荡培养 4h以上，吸取 0.5l 菌液作为PCR反应模板，其余继续培养。（2）PCR 反应体系（10l）ddH2O 9.5 lMix 12.5 l上游引物 1 l下游引物 1 l模板 1 l混匀后瞬时离心。（3）PCR 反应程序94 预变性 3 min94 变性 30 sec52 退火 30 sec 30 个循环72 延伸 1 min72 延伸
16、1 min4 （4）电泳： 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶进行电泳。重组质粒的酶切鉴定（1）挑取上述经菌液 PCR鉴定为阳性的菌落，接种到 20ml含 60g/ml Apm 的 LB液体培养基中，37、200rpm 摇床培养过夜。（2）质粒 DNA的提取（碱裂解法），加 50-100l TE（内含 50l/ml 的RNAaseA）溶解 DNA，37放置 30min，消化 RNA。（3）双酶切鉴定体系：用限制性内切核酸酶对 PCR阳性菌落提取的质粒做双酶切鉴定。酶切体系（20l）体系成分 体积质粒 5lXho(10U/l) 0.5lNde（10U/l 0.5l）10buffer 3.0lddH2O
17、11l4.5目的基因在原核细胞中的表达1) 实验试剂：LB 培养基；kan；IPTG。2) 实验步骤（1）重组质粒的转化：将重组质粒转化表达宿主菌 E.coil BL（2）重组质粒的鉴定（3）重组质粒的诱导表达五.实验结果与分析实验一：质粒 DNA 的提取和酶切电泳鉴定实验结果：当时实验时，有两个是只加氯仿，还有两个是按实验步骤操作的，结果只有两条明显的条带.如图 2所示。有条带的是 1、4 管没有条带的是 2、3 管实验分析在实验过程中，试剂添加失误或试剂配制不成功。导致未提出纯化DNA。杂质没有去除干净，DNA 没有完全提纯加入酚/氯仿没有被异戊醇/氯仿中和完全，导致那两个失败。实验二：目
18、的基因的获得和重组载体的构建实验结果 跑胶结果：与 maker比较得 bp DNA 胶重：3g 电泳检测结果：与目的基因大小一致 实验三：大肠杆菌感受态的制备和连接产物转化感受态细胞实验结果：失败，没有筛选出蓝白斑实验分析：在实验过程中，操作不严谨，不够细心小组成员在无菌操作时其他组员在旁边说话，可能谈话的过程中，使溶液或器皿受到污染，导致实验失败在涂板时，没有将溶液均匀地涂开或涂板的时间太短，导致实验失败实验四:重组质粒的酶切和 PCR鉴定实验结果：获得重组质粒 操作过程中仪器故障 实验分析：刚开始实验失败，失败的原因是 PCR仪在工作时突然停止，导致重组质粒在 PCR扩增时没有充分扩增，导
19、致实验失败。图片上最后一个条带有点暗，原因是点滴的体积太少。实验五：目的基因在原核细胞中表达实验结果:可观察到荧光络合物。如图 4所示实验分析：归功于小组团员的团结和努力六实验讨论讨论：重组质粒转化率不高，其原因可能有以下几点：（1）生长时期：实验发现在对数中期的大肠杆菌易生感受态，转化时菌浓度应控制在不超过 107个/ml。浓度过高或者过低都会影响转化效率。 （2）CaCl2法 0 放置时间的影响：细菌经 0 CaCl2处理后转化率随时间的推移而增加，24 h达到最高，之后转化率逐渐下降。 （3）化合物及无机离子的影响：在钙离子的基础上，联合其他二价金属离子或还原剂等物质处理细菌，可使转化率
20、提高 100-1000倍。 （4）质粒大小、构型的影响：用于转化的质粒 DNA应主要是超螺旋态 DNA。转化效率与外源 DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入外源 DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1 ng超螺旋 DNA即可使 50 ul的感受态细胞达到饱和。一般情况下 DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5%。 （5）防止杂菌和杂 DNA的污染：整个操作过程均应在冰浴低温和无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、EP 管等均应彻底洗净，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其他试剂、DNA酶或杂 DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂 DNA的转入，为以后的筛选、
21、鉴定带来不必要的麻烦。 （6）试剂的质量：所用的试剂，如 CaCl2等均需是最高纯度的，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。 （7）42 热处理时间很关键，转移速度要快，且温度要准确，同时注意热处理过程中离心管不要摇动。 （ 8）菌液涂平皿操作时，应避免反复来回涂，因为感受态细胞的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。心得体会：本实验设计是一个综合性的，与我们平时实验经历相比对我们的要求更多更严。它主要要求我们形成认真思考的习惯，自己查阅本实验的相关文献，分析本实验的目的，通过本实验要达到什么样的结果，达到预计的结果需要通过怎样的方案实现，根据实验需要和自己的相关
22、了解自己设置适合的实验方案，增强我们的思维能力和动手能力，同时也使我们的团队合作精神得到了提高，并学会把我们所学的知识有机的结合到一起。七参考文献参考文献1刘亮伟,陈红歌,刘新育,王明道,高玉千,梁振普,邱立友,申进文. 基因工程操作中易犯错误分析及对策J. 化工高等教育 ,2009,04:61-64.2牛延宁,刘敏,马黄如,王晖. 基因工程实验教学中检测重组 DNA 分子方法的改进J. 实验室研究与探索,2009,12:109-111.3秦红霞,王萍兰,徐玲玲,李同建. 基因工程实验教学改革与探索J. 安徽农业科学,2010,07:3813-3814+3816.4财音青格乐,杨冬,刘士望,张
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